Влияние композиции на основе бактериоцина низина в схеме лечения коров с субклиническим маститом на микробиоту молока

ВВЕДЕНИЕ

Воспаление, протекающее в молочной железе коров, чаще всего вызвано бактериальной инфекцией [1-3]. Количество обнаруживаемых бактерий зависит от формы мастита и его стадии, а также от вида патогенов [4-7]. В наибольшем количестве из секрета молочной железы коров при мастите выделяют микроорганизмы, относящиеся к следующим видам: Staphylococcus aureus, Streptococcus agalactiae, Streptococcus dysgalactiae, Escherichia coli, Enterococcus faecium, Enterococcus faecalis [1-4]. Главную опасность для молочного животноводства представляет субклиническая форма мастита, которую труднее диагностировать из-за отсутствия видимых изменений в молочной железе и молоке, однако при этом в молоке уже определяется более высокое содержание соматических клеток и повышенная бактериальная обсемененность. В полученном молоке от коров, больных субклинической формой мастита, происходит накопление метаболитов и токсинов микробных клеток, что приводит к ухудшению вкуса, снижению питательной ценности сырого молока и изготавливаемых из него продуктов, способствует значительному сокращению их срока хранения [8-11]. Заболеваемость коров субклиническим маститом имеет широкое распространение в высокопродуктивных стадах в развивающихся странах [12-16], в результате чего для уменьшения выбраковки молока и предотвращения развития антибиотикорезистентности в схемах лечения стараются минимизировать применение антимикробных препаратов, используя подходы, включающие использование вакцин, бактериофагов, фаговых лизинов, бактериоцинов [17-24]. В соответствии со «Стратегией предупреждения распространения антимикробной резистентности в РФ на период до 2030 г.», утвержденной распоряжением Правительства РФ от 25 сентября 2017 г. № 2045-р, нами были проведены исследования по разработке препаратов на основе противомикробных пептидов микробного происхождения для лечения инфекционных заболеваний молочной железы высокопродуктивных коров.

Актуальность работы заключается в использовании композиции на основе бактериоцина низина в схеме лечения коров с субклиническим маститом в качестве альтернативы известным антимикробным препаратам.

Новизна работы: впервые получены данные о влиянии новой композиции на основе бактериоцина низина в схеме лечения коров с субклиническим маститом на микробиоту молока.

Практическая значимость: с целью сдерживания развития антибиотикорезистентности применение композиции на основе бактериоцина низина дает возможность снизить использование антимикробных препаратов при лечении мастита.

Цель настоящего исследования заключалась в оценке влияния композиции на основе бактериоцина низина в схеме лечения коров с субклиническим маститом на микробиоту молока. Для этого были поставлены следующие задачи: определить состав микробиоты секрета молочной железы высокопродуктивных коров при субклиническом мастите; провести анализ сравнительной характеристики антибиотикорезистентности изолятов микроорганизмов, выделенных из секрета молочной железы больных субклиническим маститом коров; провести исследования по изучению влияния композиции на основе бактериоцина низина в схеме лечения коров с субклиническим маститом на состав микробиоты молока.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Объекты исследования: высокопродуктивные коровы с субклинической формой мастита, изоляты микроорганизмов, выделенные из секрета молочной железы коров, композиция на основе бактериоцина низина.

Экспериментальные исследования по изучению влияния композиции на основе бактериоцина низина, использованной в схеме лечения коров с субклиническим маститом, на состав микробиоты молока выполнены на 35 высокопродуктивных коровах с удоем более 8000 кг, содержащихся на базе племенного репродуктора, расположенного в Полевском районе Свердловской области. Животным в схеме лечения субклинической формы мастита ежедневно в течение пяти дней внутрицистернально в пораженную долю вводили разработанную фармацевтическую композицию в дозе 10 мл.

Все процедуры, выполненные с участием животных, соответствовали этическим стандартам, принятым Европейской конвенцией ETS № 123.

В ходе исследования в течение 2023 г. были получены изоляты: Staphylococcus aureus (n = 32), Streptococcus dysgalactiae (n = 23), Staphylococcus haemolyticus (n = 20), Enterococcus faecium (n = 19), Aerococcus viridans (n = 17), Staphylococcus epidermidis (n = 13), бактерий группы кишечной палочки (БГКП), представленных родами Escherichia и Enterobacter (n = 8), Corynebacterium pseudotuberculosis (n = 5), грибов рода Mucor (n = 4) и Penicillium spp. (n = 3).

В эксперименте использовали ранее разработанную композицию, содержащую бактериоцин низин и вспомогательные вещества на водной основе, при следующем соотношении компонентов (мас. %): низин А – 0,3; глицеролаты кремния в 6-мольном избытке глицерина Si(C₃H₇O₃)₄ × 6С₃Н₈O₃ – 3,0; бисглицеролаты бора Н[В(С₃Н₆О₃)₂] – 2,0; глицерин – 10,0; дистиллированная вода – до 100 [25][26].

Методы исследования. Идентификацию выделенных изолятов проводили путем пересева на среды Гисса с сахарами («пестрый ряд»), руководствуясь определителем бактерий Берджи [27], определителем патогенных и условно-патогенных грибов [28], и с помощью MALDI-TOF масс-спектрометрии (времяпролетная матрично-ассоциированная лазерная десорбционная/ионизационная масс-спектрометрия) на приборе VITEK® MS (bioMérieux, Франция). При проведении бактериологического и микологического исследования из проб секрета молочной железы коров делали посевы на жидкие и плотные агаризованные питательные среды: мясо-пептонный бульон, бульон для выделения стрептококков, Энтерококкагар, среду Эндо, среду № 10 (для идентификации S. aureus), среду Чапека, среду Сабуро, висмут-сульфит агар, цетримидный агар, среду Левина, среду Плоскирева (ФБУН «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии», Россия), 5%-й агар c кровью барана (основа – Колумбийский агар; Bio-Rad, Франция), кровь барана дефибринированную (E&O Laboratories Ltd., Шотландия), желточно-солевой агар (питательный агар для культивирования микроорганизмов ГРМ-агар, ФБУН «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии», Россия), хромогенный агар UriSelect4 (Bio-Rad Laboratories, Inc., США) и агар Сабуро с 2% глюкозы и хлорамфениколом (SIFIN diagnostics GmbH, Германия).

Резистентность выделенных изолятов к 34 антимикробным препаратам из 15 групп (тетрациклины, пенициллины, карбапенемы, макролиды, линкозамиды, ансамицины, амфениколы, аминогликозиды I, II, III поколения, цефалоспорины I, II, III поколения, фторхинолоны II, III поколения) определяли диско-диффузионным методом [29]. В работе использовали стандартные коммерческие диски (ООО «Научно- исследовательский центр фармакотерапии», Россия). Интерпретацию результатов проводили с учетом рекомендаций European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST).

Статистическую обработку данных проводили с использованием платформы AMRcloud, пакетов анализа Microsoft Exсel 2007, Statistica 6.0.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Исследования проводили на протяжении 2023–2024 гг. в отделе репродуктивной биологии и неонатологии, лаборатории микробиологических и молекулярно-генетических методов исследования Уральского НИВИ – структурного подразделения ФГБНУ УрФАНИЦ УрО РАН, в лаборатории медицинского центра ООО «Кволити Мед» (г. Екатеринбург) при поддержке гранта Российского научного фонда № 22-76-00009.

Согласно результатам проведенных исследований, из 70 проб секрета молочной железы от больных субклиническим маститом коров выделили 144 изолята микроорганизмов, среди них (рис. 1): S. aureus (22,2%), S. dysgalactiae (16,0%), S. haemolyticus (13,9%), E. faecium (13,2%), A. viridans (11,8%), S. epidermidis (9,0%), БГКП, представленные родами Escherichia и Enterobacter (5,6%), C. pseudotuberculosis (3,5%), а также грибы рода Mucor (2,8%) и Penicillium spp. (2,1%).

В настоящем исследовании 81,4% случаев субклинического мастита у коров протекало в виде коинфекции, из них 21,4% вызваны двумя возбудителями, в 28,6 и 17,1% случаев высеивали три и четыре патогена. Сложный микробиом, состоящий из пяти микроорганизмов, выделяли в 14,3% проб.

Доля изолятов S. aureus, резистентных к цефалоспоринам I, II и III поколений, составила 53,1; 46,8 и 37,5% соответственно; к антибиотикам группы макролидов (эритромицину, кларитромицину) – 34,4%. Устойчивость к тетрациклинам и пенициллинам выявили у 31,3 и 28,1% изолятов соответственно. Минимальный процент резистентных штаммов S. aureus зарегистрировали в отношении следующих групп антибиотиков: фторхинолоны II поколения (12,5%), фторхинолоны III поколения (9,4%), карбапенемы (6,3%). Промежуточную резистентность у 25,0% изолятов установили в отношении амикацина – антимикробного препарата группы аминогликозидов III поколения.

Выделенные штаммы S. dysgalactiae в 52,6% случаев проявили устойчивость к препаратам группы тетрациклинов (тигециклину, доксициклину). Нечувствительность к группе цефалоспоринов III поколения установили у 42,1% изолятов. Сравнительно меньшую резистентность зарегистрировали в отношении аминогликозидов II поколения (31,6%). Промежуточную устойчивость 57,9% изолятов S. dysgalactiae проявляли в отношении антибиотиков групп цефалоспоринов II поколения (цефуроксиму, цефокситину).

Мониторинг антибиотикорезистентности изолятов S. haemolyticus, выделенных из секрета молочной железы, показал в 33,3% случаев наличие резистентности к препаратам группы макролидов (эритромицину, кларитромицину). В минимальном количестве изоляты проявляли устойчивость к группе цефалоспоринов III поколения (цефиксиму, цефоперазону, цефтриаксону) и ансамицинам (рифампицину) – 13,3 и 6,7% соответственно. Промежуточную чувствительность выявили к препаратам группы тетрациклинов (доксициклину) у 6,7% изолятов.

Резистентность изолятов E. faecium наблюдали к противомикробным препаратам групп пенициллинов, аминогликозидов I поколения и цефалоспоринов III поколения (42,1; 36,8 и 26,3% соответственно). Промежуточную чувствительность установили в отношении доксициклина (группа тетрациклинов) у 21,1% выделенных изолятов.

Профиль антибиотикорезистентности изолятов A. viridans, выделенных из секрета молочной железы, характеризовался наибольшей устойчивостью к препаратам групп пенициллинов (ампициллину, амоксициллину, пенициллину) – 35,3% и аминогликозидов I поколения (канамицину) – 23,5%. Промежуточную чувствительность выявили у 29,4% исследованных изолятов к группе тетрациклинов (тетрациклину, доксициклину).

Изоляты S. epidermidis в 38,5% случаев проявляли резистентность к препаратам группы тетрациклинов (тетрациклину, доксициклину). Минимальную устойчивость (15,4%) регистрировали к препаратам группы аминогликозидов II поколения (гентамицину). У 23,1% изолятов установили промежуточную чувствительность к фторхинолонам III поколения (левофлоксацину).

Изолированные БГКП наибольшей устойчивостью (62,5%) обладали к группе пенициллинов. Резистентность к группе ансамицинов (рифампицину) установили у 37,5% изолятов кишечной палочки. У 25,0 и 12,5% штаммов БГКП зарегистрировали промежуточную чувствительность к препаратам группы пенициллинов и цефалоспоринов II поколения (цефуроксиму, цефокситину) соответственно.

У изолятов C. pseudotuberculosis установили устойчивость к антимикробным препаратам групп пенициллинов и тетрациклинов в равной степени (20,0%). Промежуточную чувствительность наблюдали к цефалоспоринам II поколения (цефуроксиму) у 40,0% изолятов.

Полученные данные по антибиотикорезистентности микробиоты молочной железы коров, больных субклиническим маститом, показали наличие полирезистентных штаммов БГКП, S. dysgalactiae, A. viridans, S. aureus. Резистентностью к двум группам антимикробных препаратов обладали 62,5 и 47,1% изученных изолятов БГКП и A. viridans соответственно. Устойчивость S. dysgalactiae к трем группам антибиотиков установили в отношении 43,5% выделенных штаммов, к четырем группам – 26,1%. Изученные изоляты S. aureus в 62,5% случаев обладали резистентностью к четырем группам антимикробных препаратов, в 46,9% – к пяти группам, устойчивость более чем к шести группам антибиотиков зарегистрировали у 15,6% изолятов.

Проведенное исследование показало, что при субклинической форме мастита из секрета молочной железы высевается сложный микробиом. Установлено широкое распространение резистентности выделенной микробиоты к основным группам антибиотиков, применяемых при терапии мастита. В связи с чем в схеме лечения субклинической формы мастита применяли новую фармацевтическую композицию на основе бактериоцина низина.

В образцах секрета молочной железы коров с субклинической формой мастита перед применением композиции, содержащей бактериоцин низин, выделенная микрофлора встречалась как в монокультуре (48,6%), так и в виде ассоциаций культур бактерий и грибов (51,4%). В монокультуре микрофлора была представлена S. aureus (22,9%), S. dysgalactiae (11,4%), A. viridans (5,7%), S. epidermidis (2,9%), C. pseudotuberculosis (2,9%), S. haemolyticus (2,9%).

В структуре ассоциаций культур бактерий 11,4% проб приходилось на S. aureus + БГКП + E. faecium, также трехкомпонентные ассоциации включали S. aureus + БГКП + Mucor (5,7%), S. aureus + Streptococcus spp. + Mucor (2,9%). При этом наиболее часто из проб секрета молочной железы высеивались четырехкомпонентные ассоциации: S. aureus + БГКП + Streptococcus spp. + Penicillium spp. (8,6%), S. aureus + БГКП + Streptococcus spp. + E. faecium (8,6%), S. aureus + БГКП + Streptococcus spp. + Mucor (5,7%), S. aureus + БГКП + E. faecium + Streptococcus spp. (2,9%). Состав пятикомпонентных ассоциаций был представлен S. aureus + БГКП + Streptococcus spp. + E. faecalis + Mucor (5,7%). Результаты отражены в таблице 1.

Всего из 35 проб секрета молочной железы коров на начало эксперимента было изолировано 80 культур микроорганизмов, из них 74 культуры бактерий и 6 культур грибов (рис. 2).

При этом количество микробных клеток бактерий в каждом образце отличалось. На начало эксперимента этиологическую значимость в развитии воспалительного процесса в молочной железе имели 28,4% изолятов S. aureus, количество колониеобразующих единиц в 1 мл исследуемой пробы (КОЕ/мл) на уровне 10³, 10⁶ и 10⁷ установлено у 9,5; 8,1 и 10,8% изолятов соответственно. Все 16 изолированных культур Streptococcus spp. (21,6%) обнаруживались в количестве 10³ КОЕ/мл. У 13,5% изолятов бактерий группы кишечной палочки, которые способны вызывать мастит у животных, количество КОЕ/мл составило 10⁵. Уровень 10³ и 10⁵ КОЕ/мл установлен у 2,7 и 8,1% выделенных изолятов E. faecium соответственно. S. epidermidis, C. pseudotuberculosis, S. haemolyticus обнаруживались в количестве 10³ КОЕ/мл в 1,4% случаев. A. viridans выявлялся в титре 10² КОЕ/мл и с начала эксперимента не являлся этиологически значимым микроорганизмом в развитии мастита у коров (табл. 2).

После курса лечения животных с субклинической формой мастита новой композицией на основе бактериоцина низина наблюдали отсутствие роста микрофлоры в 68,6% проб (табл. 1). Выделенная из 11 образцов секрета молочной железы микробиота в 20,0% случаев представляла собой монокультуру, состоящую из S. aureus (11,4%), S. dysgalactiae (5,7%), A. viridans (2,9%). В остальных пробах выявляли ассоциации микроорганизмов: S. aureus + БГКП + E. faecium (5,7%); S. aureus + БГКП (2,9%); E. faecalis + БГКП (2,9%). Количество микробных клеток S. aureus 10³ и 10⁶ КОЕ/мл наблюдали у равного количества выделенных изолятов (1,4%). В 6,8% случаев выделенный в диагностическом титре S. aureus не являлся этиологически значимым (10² КОЕ/мл), так же как и БГКП, E. faecium, A. viridans, обнаруживаемые на уровне 10¹–10² КОЕ/мл. В одной пробе E. faecium выявлен в количестве 10³ КОЕ/мл, что составило 1,4% в общей структуре изолированных микроорганизмов.

Проведенное на 14-й день с начала курса лечения микробиологическое исследование секрета молочной железы коров показало увеличение количества проб с отсутствием микрофлоры до 88,6%. В исследованных образцах микробиота секрета молочной железы коров была представлена в виде монокультуры микроорганизмов, при этом на S. aureus и БГКП приходилось 8,6 и 2,8% соответственно (табл. 1). Количество 10³ КОЕ/мл установлено у 1,4% изолятов S. aureus. Выделенные в 1,4 (10¹ КОЕ/мл) и 2,7% (10² КОЕ/мл) случаев БГКП и S. aureus соответственно не являлись этиологически значимыми в диагностическом титре (табл. 2).

В последнее десятилетие активно изучается потенциал бактериоцинов в качестве терапевтических средств следующего поколения против устойчивых к лекарствам бактерий [30-33]. Бактериоцины молочнокислых бактерий тестируются в качестве средств борьбы с бактериальными и вирусными инфекциями; показана их способность ингибировать синтез биопленки [33-35]. В ряде экспериментов установлена высокая антимикробная активность бактериоцина низина в отношении нескольких видов стафилококков, включая S. aureus, S. epidermidis, S. haemolyticus, Staphylococcus saprophyticus [36-38], в том числе метициллинрезистентного S. aureus со множественной устойчивостью к антибиотикам [39]. Имеются исследования в отношении клинических изолятов S. agalactiae, которые продемонстрировали их чувствительность к низину на разном уровне [40]. В работе M. Pérez-Ibarreche et al. [41] описаны результаты использования низина для эффективного снижения образования биопленок у штаммов Streptococcus uberis, вызывающих мастит у коров. Применение бактериоцина низина, обладающего противомикробной активностью в отношении основных возбудителей мастита, открывает возможности для его использования в качестве альтернативы антибиотикам [36][42][43]. Данные наших исследований подтверждают вышеописанные выводы о целесообразности включения низина в схемы лечения мастита. В ходе эксперимента установлено, что выделенные из секрета молочной железы возбудители мастита, такие как S. aureus, БГКП, E. faecium, Streptococcus spp., A. viridans, S. epidermidis, C. pseudotuberculosis, S. haemolyticus, обладают чувствительностью к композиции на основе бактериоцина низина. С момента открытия бактериоцинов исследователи в основном сосредоточились на определении их антимикробной активности in vitro. Однако для применения бактериоцинов в качестве противомикробных препаратов необходимо изучить их клиническую эффективность [44]. Полученные нами результаты на высокопродуктивных коровах за счет влияния композиции на основе бактериоцина низина на микробиоту молока показали эффективность использования ее в схеме лечения субклинического мастита: так, в 88,6% проб наблюдали отсутствие роста микрофлоры.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В результате проведенного исследования определен состав микробиоты секрета молочной железы высокопродуктивных коров при субклиническом мастите. Установлено, что в 81,4% случаев заболевание протекает как коинфекция, из них в 21,4 и 28,6% случаев выделяли два и три патогена соответственно. Наиболее часто изолировали S. aureus (22,2%) и S. dysgalactiae (16,0%).

Проведенный сравнительный анализ антибиотикорезистентности изолятов микроорганизмов, выделенных из секрета молочной железы коров, больных скрытой формой мастита, показал наличие полирезистентных штаммов бактерий группы кишечной палочки, S. dysgalactiae, A. viridans, S. aureus. Резистентностью к двум группам антимикробных препаратов обладали 62,5 и 47,1% изученных изолятов БГКП и A. viridans соответственно. Устойчивость S. dysgalactiae к трем группам антибиотиков установили в отношении 43,5% выделенных штаммов, к четырем группам – 26,1%. Изученные изоляты S. aureus в 62,5% случаев обладали резистентностью к четырем группам антимикробных препаратов, в 46,9% – к пяти группам, устойчивость к шести и более группам антибиотиков зарегистрировали у 15,6% изолятов.

В ходе исследования влияния композиции на основе бактериоцина низина на микробиоту молока при лечении коров с субклиническим маститом наблюдали увеличение количества проб с отсутствием микрофлоры до 88,6%. Микробиота секрета молочной железы коров в 8,6% случаев была представлена S. aureus, 2,8% приходилось на бактерии группы кишечной палочки. При этом в 1,4 и 2,7% проб БГКП и S. aureus выявляли в диагностических титрах 10¹ и 10² КОЕ/мл соответственно, поэтому не являлись этиологически значимыми микроорганизмами в развитии мастита у коров.