Изучение иммунотерапевтических свойств конъюгата антигенов БЦЖ с бетулоновой кислотой на морских свинках, инфицированных Mycobacterium scrofulaceum

ВВЕДЕНИЕ

Из насчитывающихся к настоящему времени более 190 видов микроорганизмов рода Mycobacterium значительное число представителей относится к группе нетуберкулезных микобактерий, из которых свыше 60 видов патогенны для животных и человека [1][2].

Нетуберкулезные микобактерии имеют практически повсеместное распространение в окружающей среде и создают существенную проблему в прижизненной и посмертной диагностике туберкулеза крупного рогатого скота, так как инфицирование ими вызывает ложноположительные реакции на введение туберкулина из-за наличия в аллергене антигенных детерминант, общих для нетуберкулезных и патогенных микобактерий. В дополнение к этому видимые и микроскопические изменения, индуцированные нетуберкулезными микобактериями, в некоторых случаях трудно различимы от поражений, вызванных Mycobacterium tuberculosis и Mycobacterium bovis [2][3][4][5][6].

По мере снижения распространения туберкулеза крупного рогатого скота и усиления мер по диагностике для выявления остаточной инфекции на территориях, где были внедрены программы борьбы с этой патологией, обнаруживалось увеличение числа микобактериозов, обусловленных нетуберкулезными микобактериями [7][8][9][10]. Несмотря на растущий интерес к этой проблеме, опубликованных данных о нетуберкулезных микобактериальных инфекциях по-прежнему мало, а имеющаяся литература в основном сосредоточена на комплексе Mycobacterium avium и его подвидах [11][12][13][14][15].

Для решения проблемы неспецифических реакций, индуцированных нетуберкулезными микобактериями, помимо прижизненных дифференциальных тестов (симультанная, пальпебральная пробы и др.), альтернативным направлением может служить применение специфических иммунопрофилактических или иммунотерапевтических средств. В нескольких недавних исследованиях отмечается, что выработке перекрестно-реактивного иммунитета к нетуберкулезным микобактериям способствует вакцинация БЦЖ [16][17][18][19], а также иммунизация нереактогенными конъюгатами на основе протективных антигенов, выделенных из вакцины БЦЖ, с полиионами [20]. Однако некоторые ученые утверждают, что предшествующий контакт с нетуберкулезными микобактериями может оказать антагонистическое влияние, снижая эффективность иммунизации, но это касалось только живой вакцины БЦЖ и не оказывало влияния на защитное действие инактивированных субъединичных противотуберкулезных вакцин [21][22][23][24].

По нашему мнению, перспективными в этом плане также могут быть конъюгаты антигенов БЦЖ с бетулином и его производными, бетулиновой и бетулоновой кислотами. В частности, молекулярный докинг показал, что бетулоновая кислота в большинстве случаев проявляет наивысшую ингибирующую активность в отношении белковых мишеней, являющихся структурными частями Mycobacterium tuberculosis и/или Mycobacterium bovis [25].

В связи с изложенным целью данной работы стало изучение иммунотерапевтической эффективности экспериментального конъюгата антигенов БЦЖ с бетулоновой кислотой.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Экспериментальные исследования были проведены на морских свинках линии агути в соответствии с требованиями «Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях» от 18.03.1986 и одобрены локальным независимым этическим комитетом организации по уходу и использованию лабораторных животных ФГБНУ «Омский АНЦ». Группы экспериментальных животных подбирали по принципу аналогов (масса – 400–500 г, возраст – 4–5 мес.).

Для заражения экспериментальных животных использовали 14–21-суточную культуру скотохромогенных микобактерий Mycobacterium scrofulaceum (II тип по классификации Раньона), которую вводили подкожно в область паха слева в дозе 5 мг/мл. Инокуляции культуры микобактерий были подвергнуты 10 гол., из которых сформировали 2 группы: 1-я – инфицированные Mycobacterium scrofulaceum (n = 5); 2-я – инфицированные Mycobacterium scrofulaceum и через 14 сут обработанные конъюгатом антигенов БЦЖ с бетулоновой кислотой (n = 5). Еще 5 интактных морских свинок составляли контрольную группу.

Экспериментальный конъюгат антигенных комплексов БЦЖ с бетулоновой кислотой конструировали в соответствии с авторской разработкой. Препарат животным вводили подкожно в дозе 500 мкг/мл белка. Бетулоновая кислота синтезирована на кафедре органической и экологической химии Института химии ФГАОУ ВО «Тюменский государственный университет» и любезно предоставлена для исследований профессором, доктором химических наук И. В. Кулаковым.

Микобактериальный антиген в пробах крови выявляли с помощью реакции непрямой иммунофлуоресценции в соответствии с методическими рекомендациями Н. Н. Новиковой и соавт. [26]. Активность миелопероксидазы и содержание катионных белков нейтрофилов крови оценивали с помощью бензидиновой пробы и теста с бромфеноловым синим с распределением фагоцитов по степени наполненности цитоплазмы гранулами (1, 2 и 3-я) с последующим расчетом в соответствии со стандартными методиками средних цитохимических коэффициентов (СЦК).

Аллергические исследования осуществляли с помощью внутрикожного введения туберкулина очищенного (ППД) для млекопитающих до начала эксперимента и на 21-е сут после инфицирования. Взятие крови для серологических исследований проводили на 21-е и 42-е сут после введения скотохромогенных микобактерий; для оценки функционального состояния нейтрофилов – на 14, 28 и 42-е сут.

Эвтаназию лабораторных животных осуществляли на 45-е сут от начала эксперимента с помощью ингаляционного наркоза парами эфира с последующим тотальным обескровливанием. Для гистологических исследований брали кусочки паховых лимфоузлов (регионарных к месту инокуляции культуры микобактерий, а также с противоположной стороны), помещали в кассеты с 10%-м раствором нейтрального формалина в фосфатном буфере, далее материал заливали в парафин, используя станцию MICROM EС 350 (Thermo Fisher Scientific Inc., США). Серийно гистосрезы толщиной 5–7 мкм изготовляли на роторном микротоме MICROM НМ 340 (Thermo Fisher Scientific Inc., США). Гистопрепараты окрашивали гематоксилином и эозином, а затем проводили их микроскопию.

Математическую обработку полученных данных проводили с использованием стандартных методов вариационной статистики, включающих определение средних арифметических (M) и расчет ошибок средних арифметических (m). При оценке достоверности различий (р) между двумя средними величинами Мх и Му использовали t-критерий Стьюдента. Различия результатов считали статистически достоверными при уровне значимости р ≤ 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Инокуляция морским свинкам Mycobacterium scrofulaceum сопровождалась усилением кислород-независимой активности нейтрофилов, о чем свидетельствовало увеличение числа фагоцитов с высокой наполненностью цитоплазмы гранулами (3-я степень), содержащими катионные белки, в 1-й и 2-й опытных группах соответственно в 1,60 и 1,74 раза (р < 0,01) относительно контроля. Вследствие этих изменений также происходило повышение средних цитохимических коэффициентов в 1,65 раза (табл. 1).

Состояние повышенной чувствительности замедленного типа на туберкулиновую пробу, проведенную через 21 сут после заражения морских свинок, развивалось только у 60% особей, которым не вводили экспериментальный препарат (1-я группа), тем не менее микобактериальный антиген в реакции непрямой иммунофлуоресценции обнаруживался у всех животных этой группы. Средний размер кожной припухлости у реагирующих особей составил 4,33 ± 0,33 мм.

На 28-е сут после сенсибилизации морских свинок нетуберкулезными микобактериями II группы по Раньону сохранялась идентичная тенденция, характеризующаяся достоверным увеличением концентрации катионных белков нейтрофилов в опытных группах относительно контрольной. Следует отметить, что активность антимикробных пептидов нейтрофилов была более высокой в группе животных, подвергнутых обработке экспериментальным препаратом на 14-е сут после инокуляции скотохромогенных микобактерий (2-я группа), и находилась на том же уровне, который наблюдался при исследовании двумя неделями ранее. В то же время у животных 1-й группы интенсивность метаболических процессов, напротив, была ниже по сравнению с предыдущим тестированием.

По истечении еще 14 сут наблюдалось дальнейшее снижение концентрации катионных белков у морских свинок 1-й опытной группы до уровня контрольных значений. Так, цитохимический коэффициент в среднем по группе составил 1,28 ± 0,08 у. е., а в контроле – 1,17 ± 0,12 у. е. У животных, подвергнутых иммунизации экспериментальным конъюгатом, напротив, уровень кислород-независимого метаболизма нейтрофилов возрастал за счет увеличения числа высокоактивных фагоцитов в 2,39 раза (р < 0,001) и, как следствие, среднего цитохимического коэффициента в 1,97 раза (р < 0,01).

Введение морским свинкам Mycobacterium scrofulaceum также индуцировало усиление кислород-зависимой активности нейтрофилов (табл. 2). Так, в обеих опытных группах с высокой степенью достоверности (р < 0,01) возрастал уровень среднего цитохимического коэффициента миелопероксидазы соответственно в 1,79 и 1,82 раза за счет увеличения числа высокоактивных фагоцитов в 2 раза относительно контрольной группы.

В последующие сроки исследования у морских свинок 2-й опытной группы наблюдали достоверное повышение ферментной активности миелопероксидазы. Так, среднегрупповые значения цитохимического коэффициента после введения препарата составили:

• на 14-е сут 1,70 ± 0,18 у. е. против 0,90 ± 0,06 у. е. (р< 0,05) в контроле;
• на 28-е сут 2,09 ± 0,01 у. е. против 1,03 ± 0,03 у. е. (р< 0,001) в контроле.

В 1-й опытной группе по мере увеличения срока, прошедшего после инокуляции микобактерий, напротив, происходило снижение кислород-зависимого метаболизма нейтрофилов до уровня контрольной группы к 42-м суткам от начала эксперимента.

По результатам исследований проб крови в реакции непрямой иммунофлуоресценции на 42-е сут после инокуляции Mycobacterium scrofulaceum было зарегистрировано наличие микобактериального антигена только у 2 морских свинок из 1-й опытной группы.

Таким образом, введение иммунобиологического препарата усиливает функциональную активность аэробных и анаэробных бактерицидных систем нейтрофилов, что способствует ускоренной элиминации нетуберкулезных микобактерий из организма опытных животных.

На снижение антигенной нагрузки на организм морских свинок, обработанных экспериментальным конъюгатом, также указывали результаты патогистологических исследований, проведенных на 45-е сут от начала эксперимента. Так, в регионарных паховых лимфатических узлах животных 1-й опытной группы прослеживалось увеличение численности лимфатических фолликулов с большим центром размножения (рис. 1), где регистрировалась гиперплазия макрофагов. В корковом веществе также обнаруживалось размножение макрофагов. В мозговых тяжах наблюдали в подавляющем большинстве лимфоциты и незначительную концентрацию плазмоцитов.

Для 2-й опытной группы, напротив, была характерна существенно меньшая ширина коркового вещества пахового лимфоузла. Меньшего размера были и лимфофолликулы, к тому же в них отсутствовали центры размножения (рис. 2), а в случаях наличия таких центров в них выявляли только дендритные ретикулоциты.

В прилегающих с другой стороны от места инокуляции микобактерий паховых лимфоузлах морских свинок, инфицированных Mycobacterium scrofulaceum, наблюдали значительно меньшее количество лимфатических фолликулов по сравнению с регионарными лимфоузлами этой же группы. В них реже обнаруживались центры размножения, а в центрах размножения и строме органа содержалось меньшее количество макрофагов. У животных, подвергнутых обработке препаратом (2-я группа), отмечали еще меньшее число лимфофолликулов в корковом веществе контррегионального лимфоузла.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

На основании проведенных исследований можно заключить, что сенсибилизация морских свинок Mycobacterium scrofulaceum индуцирует гиперреактивность внутриклеточных бактерицидных компонентов нейтрофилов продолжительностью до 28 сут с последующим снижением их активности до уровня, регистрируемого у животных контрольной группы. Инокуляция экспериментального препарата способствует ускоренному (через 7 сут) выведению микобактерий из организма морских свинок за счет дополнительной стимуляции иммунной функции фагоцитов, что также подтверждают результаты иммунофлуоресцентного анализа и гистологических исследований.