Отработка режима низкотемпературной консервации штаммов Bacillus anthracis

Ключевой проблемой использования чистых культур микроорганизмов является их хранение, транспортировка, восстановление жизнеспособности после длительной консервации с сохранением ценных биологических свойств. Применяемые в настоящее время противосибиреязвенные вакцины создаются с использованием различных штаммов Bacillus anthracis. На сегодняшний день штаммы возбудителя сибирской язвы, согласно данным паспортов, консервируют в 30–40-процентных растворах глицерина, позволяющих сохранять достаточное количество жизнеспособных клеток, а также свойства возбудителя в течение трех лет. Очевидно, что разработка способа консервации штаммов Bacillus anthracis для более продолжительного хранения возбудителя является актуальной задачей. Целью работы было отработать режим низкотемпературной консервации штаммов Bacillus anthracis, обеспечивающий сохранность жизнеспособности и биологических свойств возбудителя. Для проведения исследований были отобраны два вакцинных штамма Bacillus anthracis: К-СТИ-79 и 55-ВНИИВВиМ, а также две криопротекторные среды: № 1 – 15%-й раствор глицерина с 15%-м раствором глюкозы и № 2 – 30%-й нейтральный раствор глицерина на физиологическом растворе. На первом этапе были изучены биологические свойства штаммов и подсчитано количество жизнеспособных клеток. После чего штаммы были помещены на низкотемпературную консервацию при минус 40 и минус 70 °С. Через 6 месяцев хранения изучали сохранность их жизнеспособности и биологических свойств при трех режимах разморозки: при комнатной темпера- туре (22 ± 2) °С, на водяной бане при температуре (37 ± 1) °С и в бытовом холодильнике при температуре (6 ± 2) °С. Было установлено, что наиболее подходящим режимом явилось хранение клеток при минус 70 °С и размораживание на водяной бане при (37 ± 1) °С. Дальнейшие исследования будут направлены на установление максимально возможной длительности хранения штаммов при низкотемпературном режиме консервации, при которой сохранятся жизнеспособность и биологические свойства возбудителя.

1. Heylen K., Hoefman S., Vekeman B., Peiren J., De Vos P. Safeguarding bacterial resources promotes biotechnological innovation. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2012; 94: 565–574. DOI: 10.1007/s00253-011-3797-y.

2. Никитина З. К., Гордонова И. К., Насибов Э. М. Изучение коллагенолитических свойств коллекционных штаммов микромицетов при длительном хранении. Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. 2021; 24 (3): 33–39. DOI: 10.29296/25877313-2021-03-05.

3. Артемьева Е. А., Мельникова Л. А., Родионов А. П. Опыт длительного хранения референтного штамма С-141 возбудителя мелиоидоза (Burkholderia pseudomallei). Ветеринария сегодня. 2022; 11 (3): 268–272. DOI: 10.29326/2304-196X-2022-11-3-268-272.

4. Артемьева Е. А., Мельникова Л. А., Родионов А. П. Особенности подготовки и выдачи производственного штамма 5584 Burkholderia mallei в соответствии с требованиями биологической безопасности. Ветеринария сегодня. 2021; 10 (3): 243–247. DOI: 10.29326/2304-196X-2021-3-38-243-247.

5. Грачева И. В., Осин А. В. Низкотемпературная консервация коллекционных штаммов холерных вибрионов. Проблемы особо опасных инфекций. 2014; (4): 39–42. DOI: 10.21055/0370-1069-2014-4-39-42.

6. Похиленко В. Д., Баранов А. М., Детушев К. В. Методы длительного хранения коллекционных культур микроорганизмов и тенденции развития. Известия высших учебных заведений. Поволжский регион. Медицинские науки. 2009; 4 (12): 99–121. EDN: LAKPFX.

7. Fissore D., McCoy T. Editorial: freeze-drying and process analytical technology for pharmaceuticals. Front. Chem. 2018; 6:622. DOI: 10.3389/fchem.2018.00622.

8. Грачева И. В., Валова Т. В., Григорьева Г. В. Традиционные и новые защитные среды для низкотемпературной консервации бактерий. Проблемы особо опасных инфекций. 2011; (4): 36–40. DOI: 10.21055/0370-1069-2011-4(110)-36-40.

9. Молчанова Е. В., Агеева Н. П. Научно-методические аспекты совершенствования деятельности коллекции патогенных микроорганизмов Волгоградского научно-исследовательского противочумного института. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2018; 95 (3): 117–126. DOI: 10.36233/0372-9311-2018-3-117-126.

10. Cui S., Hu K., Qian Z., Mao B., Zhang Q., Zhao J., et al. Improvement of freeze-dried survival of Lactiplantibacillus plantarum based on cell membrane regulation. Microorganisms. 2022; 10 (10):1985. DOI: 10.3390/microorganisms10101985.

11. Малахаева А. Н., Ляшова О. Ю., Плотников О. П., Осин А. В. Хранение штаммов Francisella tularensis 15 НИИЭГ и Brucella abortus 19 ВА в жизнеспособном состоянии путем их глубокого замораживания. Проблемы особо опасных инфекций. 2015; (1): 63–66. DOI: 10.21055/0370-1069-2015-1-63-66.

12. Савкина О. А., Терновской Г. В., Локачук М. Н., Павловская Е. Н., Сафронова В. И. Криоконсервация – перспективный метод хранения промышленно ценных штаммов молочнокислых бактерий и дрожжей. Сельскохозяйственная биология. 2014; 49 (4): 112–119. DOI: 10.15389/agrobiology.2014.4.112rus.

13. Ермолова В. П., Гришечкина С. Д., Нижников А. А. Активность энтомопатогенных штаммов-продуцентов Bacillusthuringiensis var. israelensis при разных методах хранения. Сельскохозяйственная биология. 2018; 53 (1): 201–208. DOI: 10.15389/agrobiology.2018.1.201rus.

14. Liu M., Chen C., Yu J., Zhang H., Liang L., Guo B., et al. The gelatin-based liquid marbles for cell cryopreservation. Mater. Today Bio. 2022; 17:100477. DOI: 10.1016/j.mtbio.2022.100477.

15. Ali P., Fucich D., Shah A. A., Hasan F., Chen F. Cryopreservation of cyanobacteria and eukaryotic microalgae using exopolysaccharide extracted from a glacier bacterium. Microorganisms. 2021; 9 (2):395. DOI: 10.3390/microorganisms9020395.

16. Сидорчук А. А. История создания вакцин и вакцинации. Часть II. Оспа и сибирская язва. Российский ветеринарный журнал. 2018; (6): 12–14. DOI: 10.32416/article_5c050ab91c6a36.36611669.

17. Сидорчук А. А. История создания вакцин и вакцинации. Часть III. Бешенство и туберкулез. Российский ветеринарный журнал. 2019; (2): 25–28. DOI: 10.32416/article_5cd16d076a75a6.23029629.

18. Сидорчук А. А. История создания вакцин и вакцинации. Часть IV. Чума и контагиозная плевропневмония крупного рогатого скота. Российский ветеринарный журнал. 2019; (6): 35–38. DOI: 10.32416/2500-4379-2019-2019-6-35-38.

19. Сидорчук А. А. История создания вакцин и вакцинации. Часть V. Ящур. Российский ветеринарный журнал. 2020; (2): 27–30. DOI: 10.32416/2500-4379-2020-2-27-30.

20. Родионов А. П., Артемьева Е. А., Мельникова Л. А., Косарев М. А., Иванова С. В. Особенности природной очаговости сибирской язвы и экологии Bacillus anthracis. Ветеринария сегодня. 2021; (2): 151–158. DOI: 10.29326/2304-196X-2021-2-37-151-158.

21. Лягоскин И. В., Васина Н. К., Егорова И. Ю., Селянинов Ю. О. Конструирование сибиреязвенных эритроцитарных антигенных диагностикумов. Вестник Российской академии сельскохозяйственных наук. 2012; (6): 73–76. EDN: PMBHXL.

22. Егорова И. Ю., Севских Т. А., Селянинов Ю. О. Иммунобиологические свойства нового бескапсульного штамма Bacillus anthracis 363/11. Биотехнология. 2015; 31 (5): 34–40. EDN: VLDZXL.

23. Жилченко Е. Б., Жаринова Н. В., Сердюк Н. С., Коняева О. А., Гаврилова О. Н. Обеспечение биологической безопасности при лиофилизации микроорганизмов I–II групп патогенности. Здоровье населения и среда обитания – ЗНиСО. 2019; (1): 46–50. DOI: 10.35627/2219-5238/2019-310-1-46-50.

24. Баврина А. П. Современные правила применения параметрических и непараметрических критериев в статистическом анализе медико-биологических данных. Медицинский альманах. 2021; 1 (66): 64–73. EDN: IZXMBZ.

25. Hubálek Z. Protectants used in the cryopreservation of microorganisms. Cryobiology. 2003; 46 (3): 205–229. DOI: 10.1016/s0011-2240(03)00046-4.

26. Hasan M., Fayter A. E. R, Gibson M. I. Ice recrystallization inhibiting polymers enable glycerol-free cryopreservation of microorganisms. Biomacromolecules. 2018; 19 (8): 3371–3376. DOI: 10.1021/acs.biomac.8b00660.