Разработка способа глубинного культивирования вакцинного штамма Mycoplasma mycoides subsp. mycoides

Представители рода Mycоplasma широко распространены в природе (почве, воде, навозе, злаках, пищевых продуктах), среди них имеются виды, патогенные для человека, животных и птиц. К группе особо опасных инфекционных болезней отнесена контагиозная плевропневмония крупного рогатого скота, возбудителем которой является Mycoplasma mycoides subsp. mycoides. В настоящее время риск заноса возбудителя инфекции на территорию России с импортным скотом и сырьем из неблагополучных регионов сохраняется. В связи с этим совершенствование технологии изготовления вакцины против контагиозной плевропневмонии является актуальной задачей. Целью данного исследования явилась разработка глубинного способа культивирования вакцинного штамма Mycoplasma mycoides subsp. mycoides. Данный метод позволяет получать за короткий промежуток биомассу в больших объемах и упрощает технологию изготовления биопрепаратов. В процессе работы изучена динамика накопления биомассы микоплазмы при безопорном методе культивирования. Наглядно продемонстрированы 4 фазы роста бактерии. В первые двое суток выращивания отмечали незначительное снижение концентрации микробных клеток, третьи – четвертые сутки характеризовались увеличением биомассы на несколько порядков от 2,5 × 10⁸ до 4,5 × 10⁹ клеток в единице объема, на 5-е сутки концентрация находилась в равновесном положении, и начиная с 6-х суток регистрировали наступление фазы гибели микроорганизма. Аналогичная динамика прослеживалась и при культивировании в биореакторе. При визуализации микоплазмы, полученной при выращивании глубинным способом, на твердой питательной среде наблюдали единичные колонии или их скопления, имеющие вид яичницы-глазуньи. Таким образом, используя безопорный метод культивирования и такие параметры, как засев микоплазмы в дозе 10⁵  микробных клеток в единице объема, объем заполнения на 2/3, температура инкубирования (37 ± 0,5) °С, перемешивание при 90 об/мин, а также применение синтетической питательной среды бактерия накапливается в титре 10⁹  клеток в единице объема.

1. Медведев А. П., Вербицкий А. А. Основы получения противобактериальных вакцин и сывороток: монография. Витебск: ВГАВМ; 2010. 196 с.

2. Фирсова М. С., Евграфова В. А., Потехин А. В. Подбор питательной среды и оптимизация режима глубинного культивирования Avibacterium paragallinarum. Ветеринария сегодня. 2019; (2): 12–16. DOI: 10.29326/2304-196X-2019-2-29-12-16.

3. Шепелев И. А., Волох О. А., Еремин С. А., Авдеева Н. Г., Кузнецова Е. М. Способ получения биомассы туляремийного микроба. Патент № 2451743 Российская Федерация, МПК C12N 1/20 (2006.01), C12R 1/00 (2006.01). «РосНИПЧИ «Микроб». № 2010131275/10. Заявл. 26.07.2010. Опубл. 27.05.2012. Бюл. № 15. Режим доступа: https://patentimages.storage.googleapis.com/27/d7/d2/cc31eed5004cbb/RU2451743C2.pdf.

4. Лиморенко А. П. Разработка технологии глубинного способа культивирования микроорганизмов B. subtilis и B. licheniformis для производства пробиотиков: дис. … канд. биол. наук. М.; 2002. 149 с.

5. Панкратова Н. А., Табакова Д. А., Гусева Е. В. Исследование процесса культивирования Е. coli в реакторе периодического действия. Успехи в химии и химической технологии. 2017; 31 (9): 32–33. EDN: ZTMGJD.

6. Bonnet M., Lagier J. C., Raoult D., Khelaifia S. Bacterial culture through selective and non-selective conditions: the evolution of culture media in clinical microbiology. New Microbes New Infect. 2019; 34:100622. DOI: 10.1016/j.nmni.2019.100622.

7. March J. B., Clark J., Brodlie M. Characterization of strains of Mycoplasma mycoides subsp. mycoides small colony type isolated from recent outbreaks of contagious bovine pleuropneumonia in Botswana and Tanzania: evidence for a new biotype. J. Clin. Microbiol. 2000; 38 (4): 1419–1425. DOI: 10.1128/JCM.38.4.1419-1425.2000.

8. Козлов Д. А., Волков М. С., Черняева Т. Ю., Сорокина М. И., Ирза В. Н. Влияние сыворотки крови крупного рогатого скота на ростовые свойства питательной среды для культивирования Mycoplasma gallisepticum и Mycoplasma synoviae. Ветеринария сегодня. 2022; 11 (2): 156–162. DOI: 10.29326/2304-196X-2022-11-2-156-162.

9. Орлова С. Т., Сидорчук А. А., Гребенникова Т. В. Культивирование микоплазм – ретроспектива и перспективы. Российский ветеринарный журнал. 2018; (5): 6–13. DOI: 10.32416/article_5d1caf6645a4b1.87344381.

10. Суханова С. М., Бердникова З. Е., Тихонова А. С. Совершенствование методики оценки качества питательной среды для выявления микоплазм. БИОпрепараты. Профилактика, диагностика, лечение. 2019; 19 (3): 161–168. DOI: 10.30895/2221-996X-2019-19-3-161-168.

11. Бессарабов Б. Ф., Вашутин А. А., Воронин Е. С. и др. Инфекционные болезни животных. Под ред. А. А. Сидорчука. М.: КолосC; 2007. 671 с.

12. Amanfu W. Contagious bovine pleuropneumonia (lungsickness) in Africa. Onderstepoort J. Vet. Res. 2009; 76 (1): 13–17. DOI: 10.4102/ojvr.v76i1.55.

13. Di Teodoro G., Marruchella G., Di Provvido A., D’Angelo A. R., Orsini G., Di Giuseppe P., et al. Contagious bovine pleuropneumonia: a comprehensive overview. Vet. Pathol. 2020; 57 (4): 476–489. DOI: 10.1177/0300985820921818.

14. Karimuribo E. D., Kambarage D. M., Lema B., Kazwala R. R., Mtambo M. M. A., Kusiluka L. J. M. Factors influencing the effective control of contagious bovine pleuropneumonia (CBPP) in Tanzania. Tanzania Veterinary Journal. 1997; 17 (3): 195–206.

15. Tambi N. E., Maina W. O., Ndi C. L. An estimation of the economic impact of contagious bovine pleuropneumonia in Africa. Rev. Sci. Tech. 2006; 25 (3): 999–1011. DOI: 10.20506/rst.25.3.1710.

16. Alhaji N. B., Ankeli P. I., Ikpa L. T., Babalobi O. O. Contagious bovine pleuropneumonia: challenges and prospects regarding diagnosis and controlstrategiesin Africa. VeterinaryMedicine: Research and Reports. 2020; 11: 71–85. DOI: 10.2147/VMRR.S180025.

17. Пискунов А. В., Кононов А. В., Мищенко А. В. Проблема контагиозной плевропневмонии крупного рогатого скота. Ветеринария сегодня. 2016; (3): 27–36.

18. WOAH. Infection with Mycoplasma mycoides subsp. mycoides SC (contagious bovine pleuropneumonia). Chapter 11.5. Режим доступа: https://www.woah.org/en/what-we-do/standards/codes-and-manuals/terrestrial-code-online-access/?id=169&L=1&htmfile=chapitre_mycoplasma_mycoides.htm.

19. Сергеев В. А. Репродукция и выращивание вирусов животных. М.: Колос; 1976. 303 с.

20. Медведев А. П., Вербицкий А. А., Асташонок Ю. О., Огурцова К. А. Динамика накопления бакмассы сальмонелл при их глубинном культивировании. Ветеринарный журнал Беларуси. 2018; 1 (8): 9–11. Режим доступа: https://repo.vsavm.by/bitstream/123456789/5113/1/j-2018-1-9-11.pdf.

21. Самуйленко А. Я., Рубан Е. А. Основы технологии производства ветеринарных биологических препаратов: в 2 т. М.: ВНИТИБП; 2000. 782 с