Разработка тест-системы для обнаружения РНК вируса SARS-CoV-2 в биоматериале от животных методом полимеразной цепной реакции

Сегодня внимание всего мирового сообщества приковано к одной общей проблеме – распространению новой коронавирусной инфекции (COVID-19). С конца декабря 2019 г. коронавирус SARS-CoV-2 охватил большинство стран мира, и 11 марта 2020 г. Всемирной организацией здравоохранения была объявлена пандемия. Глобальное распространение COVID-19 не ограничилось человеческой популяцией, и возникла необходимость тестирования домашних и сельскохозяйственных животных, находящихся в контакте с человеком. Появляется все больше сообщений о выявлении SARS-CoV-2 у норок, хорьков, собак, кошек, тигров, львов и других животных. Основным методом диагностики COVID-19 на сегодняшний день является полимеразная цепная реакция, однако все существующие в настоящее время тест-системы предназначаются для выявления вируса у людей. В статье представлены данные по разработке метода обнаружения РНК вируса SARS-CoV-2 в биоматериале от животных с помощью полимеразной цепной реакции в реальном времени. В процессе проведенных исследований выбрана оптимальная система праймеров и зонд, отработаны условия реакции, определены основные валидационные характеристики метода (чувствительность, специфичность, воспроизводимость). В результате проведения валидации установлено, что он отвечает требованиям, предъявляемым к качественным методам измерений/испытаний, и может применяться в диагностических исследованиях. На основе разработанного метода создана тест-система для выявления РНК вируса SARS-CoV-2 в биоматериале от животных, которая внедрена в ветеринарную практику. Проведены скрининговые исследования популяций животных из различных регионов Российской Федерации с целью выявления генома нового коронавируса. Показано, что среди травоядных животных Российской Федерации вирус SARS-CoV-2 не встречается. Среди домашних животных-компаньонов специалистами ФГБУ «ВНИИЗЖ» был зафиксирован лишь один положительный случай. 

1. Zhou P., Yang X. L., Wang X. G., Hu B., Zhang L., Zhang W., et al. A pneumonia outbreak associated with a new coronavirus of probable bat origin. Nature. 2020; 579 (7798): 270–273. DOI: 10.1038/s41586-020- 2012-7.

2. Gorbalenya A. E., Baker S. C., Baric R. S., de Groot R. J., Drosten C., Gulyaeva A. A. The species Severe acute respiratory syndrome-related coronavirus: classifying 2019-nCoV and naming it SARS-CoV-2. Nat. Microbiol. 2020; 5 (4): 536–544. DOI: 10.1038/s41564-020-0695-z.

3. Kiros M., Andualem H., Kiros T., Hailemichael W., Getu S., Geteneh A., et al. COVID-19 pandemic: current knowledge about the role of pets and other animals in disease transmission. Virol. J. 2020; 17 (1):143. DOI: 10.1186/s12985-020-01416-9.

4. Ciotti M., Ciccozzi M., Terrinoni A., Jiang W. C., Wang C. B., Bernardini S. The COVID-19 pandemic. Crit. Rev. Clin. Lab. Sci. 2020; 57 (6): 365–388. DOI: 10.1080/10408363.2020.1783198.

5. Hsih W. H., Cheng M. Y., Ho M. W., Chou C. H., Lin P. C., Chi C. Y., et al. Featuring COVID-19 cases via screening symptomatic patients with epidemiologic link during flu season in a medical center of central Taiwan. J. Microbiol. Immunol. Infect. 2020; 53 (3): 459–466. DOI: 10.1016/j. jmii.2020.03.008.

6. do Vale B., Lopes A. P., Fontes M. D. C., Silvestre M., Cardoso L., Coelho A. C. Bats, pangolins, minks and other animals – villains or victims of SARS-CoV-2? Vet. Res. Commun. 2021; 45 (1): 1–19. DOI: 10.1007/s11259- 021-09787-2.

7. CuiJ., Li F., Shi Z. L. Origin and evolution of pathogenic coronaviruses. Nat. Rev. Microbiol. 2019; 17 (3): 181–192. DOI: 10.1038/s41579-018-0118-9.

8. Ning S., Yu B., WangY., Wang F. SARS-CoV-2: origin, evolution, and targeting inhibition. Front. Cell. Infect. Microbiol. 2021; 11:676451. DOI: 10.3389/ fcimb.2021.676451.

9. Wang M. Y., Zhao R., Gao L. J., Gao X. F., Wang D. P., Cao J. M. SARS-CoV-2: structure, biology, and structure-based therapeutics development. Front. Cell. Infect. Microbiol. 2020; 10:587269. DOI: 10.3389/ fcimb.2020.587269.

10. Farag E. A., Islam M. M., Enan K., El-Hussein A. M., BansalD., Haroun M. SARS-CoV-2 at the human-animal interphase: A review. Heliyon. 2021; 7 (12):e08496. DOI: 10.1016/j.heliyon.2021.e08496.

11. Никонова З. Б., Овчинникова Е. В., Щербакова Л. О., Козлов А. А., Жестков П. Д., Зиняков Н. Г. и др. Выявление возбудителя COVID-19 у животных в 2020–2021 гг. Молекулярная диагностика: X Юбилейная международная научно-практическая конференция (9–11 ноября, 2021 г.). М.: Юлиус; 2021; 2: 379–380. eLIBRARY ID: 47983412.

12. Акимова Т. П., Семакина В. П., Митрофанова М. Н., Жильцова М. В., Выставкина Е. С., Исакова Д. Г. и др. Распространение коронавируса SARS-CоV-2 среди людей и животных. Ветеринария сегодня. 2021; (2): 88–96. DOI: 10.29326/2304-196X-2021-2-37-88-96.

13. Parolin C., Virtuoso S., Giovanetti M., Angeletti S., Ciccozzi M., Borsetti A. Animal hosts and experimental models of SARS-CoV-2 infection. Chemotherapy. 2021; 66 (1–2): 8–16. DOI: 10.1159/000515341.

14. Meekins D. A., Gaudreault N. N., Richt J. A. Natural and experimental SARS-CoV-2 infection in domestic and wild animals. Viruses. 2021; 13 (10):1993. DOI: 10.3390/v13101993.

15. Michelitsch A., Wernike K., Ulrich L., Mettenleiter T. C., Beer M. SARS CoV-2 in animals: From potential hosts to animal models. Adv. Virus. Res. 2021; 110: 59–102. DOI: 10.1016/bs.aivir.2021.03.004.

16. Sharun K., Dhama K., Pawde A. M., Gortázar C., Tiwari R., Bonilla-Aldana D. K., et al. SARS-CoV-2 in animals: potential for unknown reser-voir hosts and public health implications. Vet. Q. 2021; 41 (1): 181–201. DOI: 10.1080/01652176.2021.1921311.

17. Prince T., Smith S. L., Radford A. D., Solomon T., Hughes G. L., Patterson E. I. SARS-CoV-2 infections in animals: reservoirs for reverse zoonosis and models for study. Viruses. 2021; 13 (3):494. DOI: 10.3390/v13030494.

18. Maurin M., Fenollar F., Mediannikov O., Davoust B., Devaux C., Raoult D. Current status of putative animal sources of SARS-CoV-2 infection in humans: wildlife, domestic animals and pets. Microorganisms. 2021; 9 (4):868. DOI: 10.3390/microorganisms9040868.

19. Hossain M. G., Javed A., Akter S., Saha S. SARS-CoV-2 host diversity: An update of natural infections and experimental evidence. J. Microbiol. Immunol. Infect. 2021; 54 (2): 175–181. DOI: 10.1016/j.jmii.2020.06.006.

20. Dhar B. C. Diagnostic assay and technology advancement for detecting SARS-CoV-2 infections causing the COVID-19 pandemic. Anal. Bioanal. Chem. 2022; 414 (9): 2903–2934. DOI: 10.1007/s00216-022-03918-7.

21. Kabir M. A., Ahmed R., Iqbal S. M. A., Chowdhury R., Paulmurugan R., Demirci U., Asghar W. Diagnosis for COVID-19: current status and future prospects. Expert Rev. Mol. Diagn. 2021; 21 (3): 269–288. DOI: 10.1080/14 737159.2021.1894930.

22. Chen Q., He Z., Mao F., Pei H., Cao H., Liu X. Diagnostic technologies for COVID-19: a review. RSC Adv. 2020; 10 (58): 35257–35264. DOI: 10.1039/ d0ra06445a.

23. Filchakova O., Dossym D., Ilyas A., Kuanysheva T., Abdizhamil A., Bukasov R. Reviewof COVID-19 testing and diagnostic methods. Talanta. 2022; 244:123409. DOI: 10.1016/j.talanta.2022.123409.

24. Corman V. M., Landt O., Kaiser M., Molenkamp R., Meijer A., Chu D. K., et al. Detection of 2019 novel coronavirus (2019-nCoV) by realtime RT-PCR. Euro Surveill. 2020; 25 (3):2000045. DOI: 10.2807/1560-7917. ES.2020.25.3.2000045.

25. Long C., Xu H., Shen Q., Zhang X., Fan B., Wang C., et al. Diagnosis of the coronavirus disease (COVID-19): rRT-PCR or CT? Eur. J. Radiol. 2020; 126:108961. DOI: 10.1016/j.ejrad.2020.108961.

26. Kevadiya B. D., Machhi J., Herskovitz J., Oleynikov M. D., Blomberg W. R., Bajwa N., et al. Diagnostics for SARS-CoV-2 infections. Nat. Mater. 2021; 20 (5): 593–605. DOI: 10.1038/s41563-020-00906-z.

27. Smyrlaki I., Ekman M., Lentini A., Rufino de Sousa N., Papanicolaou N., Vondracek M., et al. Massive and rapid COVID-19 testing isfeasible by extraction-free SARS-CoV-2 RT-PCR. Nat. Commun. 2020; 11 (1):4812. DOI: 10.1038/s41467-020-18611-5.

28. Грибанов О. Г., Щербаков А. В., Перевозчикова Н. А., Гусев А. А. Использование аэросила А-300 и фильтров GF/F (GF/C) для очистки фрагментов ДНК, ДНК-плазмид и РНК. Биохимия. 1996; 61 (6): 1064–1070. Режим доступа: https://biochemistrymoscow.com/ru/ archive/1996/61-06-1064/#_pdf.

29. Носырев П., Носырева М., Рассказова Т., Корнеева Н. Практикум по GMP. Валидация аналитических методик: теория и практика. Ремедиум. 2003; 10: 69–71; 11: 62–64.

30. Поляков И. В., Соколова Н. С. Практическое пособие по медицинской статистике. М.: Медицина; 1975. 151 с.