Электропорация эмбриональных стволовых клеток мыши с помощью прибора Neon

Эмбриональные стволовые клетки мыши широко используются в качестве перспективного материала для создания новых клеточных систем с заданными свойствами в клеточной и молекулярной биологии, фармакологии, вирусологии, медицине, ветеринарии и биотехнологии. Для каждого типа клеток требуются разные условия электропорации, которые должны быть определены экспериментально, поэтому была поставлена цель путем подбора и изменения различных параметров (напряжения, ширины импульса и количества импульсов) оптимизировать условия электропорации при использовании электропоратора нового поколения Neon® Transfection System, обеспечивающие высокую эффективность трансфекции эмбриональных стволовых клеток линии D3 и их жизнеспособность. Установлено, что наиболее подходящими параметрами для данных клеток являются: импульсное напряжение – 1200 V, ширина импульса – 10 ms, количество импульсов – 3. При данных условиях жизнеспособность клеток после электропорации составила 91%, а эффективность временной трансфекции (24 ч после электропорации), оцениваемая по продукции бактериальной β-галактозидазы, достигала 88%. Показано, что при более высокой клеточной концентрации любые испытанные режимы электропорации обеспечивают более высокую эффективность трансфекции в диапазоне от 34 до 88%. Продемонстрировано, что для введения ДНК плазмиды с геном lacZ Escherichiacoli в клетки линии D3 из 12 изученных протоколов с разными параметрами можно успешно использовать 5. Таким образом, полученные в эксперименте результаты показывают, что, имея предварительную информацию о режимах электропорации аналогичного типа клеток, которую рекомендует производитель прибора, можно подобрать экспериментальным путем более оптимальные условия. Электропорация эмбриональных стволовых клеток мыши с использованием электропоратора нового поколения может быть эффективным методом введения нуклеиновых кислот в представляющие интерес для исследователя клетки in vitro.

1. Evans M. J., Kaufman M. H. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos. Nature. 1981; 292 (5819): 154–156. DOI:10.1038/292154a0.

2. Martin G. R. Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1981; 78 (12): 7634–7638. DOI:10.1073/pnas.78.12.7634.

3. Савченкова И. П., Зиновьева Н. А., Булла Й., Брем Г. Эмбриональные стволовые клетки, их генетическое изменение путем гомологичной рекомбинации и использование в получении трансгенных животных. Успехи современной биологии. 1996; 116 (1): 78–92.

4. Савченкова И. П., Сергеев Н. И. Введение экзогенной ДНК плазмид в культуру клеток сельскохозяйственных животных. Доклады Российской академии сельскохозяйственных наук. 1994; 6: 26–28. eLIBRARY ID: 22275920.

5. Shi J., Ma Y., Zhu J., Chen Y., Sun Y., Yao Y., et al. Electroporation-based intracellular delivery. Molecules. 2018; 23 (11):3044. DOI:10.3390/molecules23113044.

6. Villemejane J., Mir L. M. Physical methods of nucleic acid transfer: general concepts and applications. British J. Pharmacol. 2009; 157 (2): 207–219. DOI:10.1111/j.1476-5381.2009.00032.x.

7. Chong Z. X., Yeap S. K., Ho W. Y. Transfection types, methods and strategies: a technical review. PeerJ. 2021; 9:e11165. DOI:10.7717/peerj.11165.

8. Савченкова И. П. Введение гена lac-Z Е. coli в эмбриональные стволовые клетки мыши D3 электропорацией. Доклады Российской академии сельскохозяйственных наук. 1996; 6: 36–37. eLIBRARY ID: 22272344.

9. Moore J. C., Atze K., Yeung P. L., Toro-Ramos A. J., Camarillo C., Thompson K., et al. Efficient, high-throughput transfection of human embryonic stem cells. Stem Cell Res. Ther. 2010; 1 (3):23. DOI:10.1186/scrt23.

10. Covello G., Siva K., Adami V., Denti M. A. An electroporation protocol for efficient DNA transfection in PC12 cells. Cytotechnology. 2014; 66 (4): 543–553. DOI:10.1007/s10616-013-9608-9.

11. Kim J. A., Cho K., Shin M. S., Lee W. G., Jung N., Chung C., Chang J. K. A novel electroporation method using a capillary and wire-type electrode. Biosens. Bioelectron. 2008; 23 (9): 1353–1360. DOI:10.1016/j.bios.2007.12.009.

12. Савченкова И. П., Алексеенкова С. В., Юров К. П. Эмбриональные стволовые клетки мыши – перспективный материал для изучения вируса инфекционной анемии лошадей in vitro и in vivo. Вопросы вирусологии. 2016; 61 (3): 107–111. DOI:10.18821/0507-4088-2016-61-3-107-111.

13. Gardner C. L., Trobaugh D. W., Ryman K. D., Klimstra W. B. Electroporation of alphavirus RNA translational reporters into fibroblastic and myeloid cells as a tool to study the innate immune system. Methods Mol. Biol. 2016; 1428: 127–137. DOI:10.1007/978-1-4939-3625-0_8.

14. Slanina H., Schmutzler M., Christodoulides M., Kim K. S., Schubert-Unkmeir A. Effective plasmid DNA and small interfering RNA delivery to diseased human brain microvascular endothelial cells. J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 2012; 22 (4): 245–257. DOI:10.1159/000342909.

15. Yunus M. A., Chung L. M., Chaudhry Y., Bailey D., Goodfellow I. Development of an optimized RNA-based murine norovirus reverse genetics system. J. Virol. Methods. 2010; 169 (1): 112–118. DOI:10.1016/j.jviromet.2010.07.006.

16. Eghbalsaied S., Hyder I., Kues W. A. A versatile bulk electrotransfection protocol for murine embryonic fibroblasts and iPS cells. Sci. Rep. 2020; 10 (1):13332. DOI:10.1038/s41598-020-70258-w.

17. Brees C., Fransen M. A cost-effective approach to microporate mammalian cells with the Neon Transfection System. Anal. Biochem. 2014; 466: 49–50. DOI:10.1016/j.ab.2014.08.017.

18. Yu L., Reynaud F., Falk J., Spencer A., Ding Y. D., Baumlé V., et al. Highly efficient method for gene delivery into mouse dorsal root ganglia neurons. Front. Mol. Neurosci. 2015; 8:2. DOI:10.3389/fnmol.2015.00002.