Оптимизация состава питательной среды и изучение стадий роста изолята «Калуга 2020» Mycoplasma bovis

Mycoplasma bovis является одним из возбудителей микоплазмозов крупного рогатого скота, вызывающим респираторные болезни, мастит, артрит и кератоконъюнктивит. В статье представлены результаты исследования по оптимизации компонентного состава питательной среды для культивирования изолята «Калуга 2020» Mycoplasma bovis, а также изучения стадий роста возбудителя. Для определения активности микоплазм использовали метод измерения цветоизменяющих единиц и культуральный метод с подсчетом колониеобразующих единиц. Установлено, что при культивировании в оптимизированной питательной среде на основе модифицированного бульона Хейфлика микроорганизм вступает в фазу логарифмического роста по истечении первых 24 ч роста, через 72 ч культура микоплазм переходит в стабильный период, а через 84 ч регистрируется фаза спада. Влияние процентного содержания глюкозы, свежего дрожжевого экстракта и сыворотки крови лошади в питательной среде на накопление изолята «Калуга 2020» Mycoplasma bovis оценивали с использованием метода «один фактор за раз». Было установлено, что наибольшее влияние на накопление микоплазм оказывало содержание в питательной среде таких факторов роста, как свежий дрожжевой экстракт и сыворотка крови лошади (p < 0,05), в то время как изменение количества глюкозы не стимулировало рост Mycoplasma bovis. В результате проведенных исследований определен подходящий состав и подобрано оптимальное содержание факторов роста в среде для культивирования изолята «Калуга 2020» Mycoplasmabovis: 12,5% свежего дрожжевого экстракта и 25% сыворотки крови лошади. Применение оптимизированной питательной среды на основе модифицированного бульона Хейфлика позволило увеличить накопление биомассы микоплазм в 5 раз (3,98 × 10⁹  КОЕ/мл) по сравнению со стандартной средой (0,79 × 10⁹  КОЕ/мл).

1. Абед Алхуссен М., Нестеров А. А., Кирпиченко В. В., Яцентюк С. П., Спрыгин А. В., Бьядовская О. П., Кононов А. В. Распространение микоплазмозов крупного рогатого скота на животноводческих фермах в Российской Федерации в период с 2015 по 2018 год. Ветеринария сегодня. 2020; (2): 102–108. DOI:10.29326/2304-196X-2020-2-33-102-108.

2. Parker A. M., Sheehy P. A., Hazelton M. S., Bosward K. L., House J. K. A review of mycoplasma diagnostics in cattle. J. Vet. Intern. Med. 2018; 32 (3): 1241–1252. DOI:10.1111/jvim.15135.

3. Kurćubić V., Doković R., Ilić Z., Petrović M. Etiopathogenesis and economic significance of bovine respiratory disease complex (BRDC). Acta Agric. Serbica. 2018; 23 (45): 85–100. DOI:10.5937/AASer1845085K.

4. Niu J., Wang D., Yan M., Chang Z., Xu Y., Sizhu S., et al. Isolation, identification and biological characteristics of Mycoplasma bovis in yaks. Microb. Pathog. 2021; 150:104691. DOI:10.1016/j.micpath.2020.104691.

5. Hale H. H., Helmboldt C. F., Plastridge W. N., Stula E. F. Bovine mastitis caused by a Mycoplasma species. Cornell Vet. 1962; 52: 582–591. PMID:13952069.

6. Абед Алхуссен М., Кирпиченко В. В., Яцентюк С. П., Нестеров А. А., Бьядовская О. П., Жбанова Т. В., Спрыгин А. В. Патогенные микоплазмы крупного рогатого скота Mycoplasma bovis, M. bovigenitalium и M. dispar: краткая характеристика возбудителей (обзор). Сельскохозяйственная биология. 2021; 56 (2): 245–260. DOI:10.15389/agrobiology.2021.2.245rus.

7. Nicholas R. A., Ayling R. D. Mycoplasma bovis: disease, diagnosis, and control. Res. Vet. Sci. 2003; 74 (2): 105–112. DOI:10.1016/s00345288(02)00155-8.

8. Andersson A. M., Aspán A., Wisselink H. J., Smid B., Ridley A., Pelkonen S., et al. European inter-laboratory trial to evaluate the performance of three serological methods for diagnosis of Mycoplasma bovis infection in cattle using latent class analysis. BMC Vet. Res. 2019; 15 (1): 369. DOI:10.1186/s12917-019-2117-0.

9. Montagnani F., Rossetti B., Vannoni A., Cusi M. G., De Luca A. Laboratory diagnosis of Mycoplasma pneumoniae infections: data analysis from clinical practice. New Microbiol. 2018; 41 (3): 203–207. PMID:29874388.

10. Pfützner H., Sachse K. Mycoplasma bovis as an agent of mastitis, pneumonia, arthritis and genital disorders in cattle. Rev. Sci. Tech. 1996; 15 (4): 1477–1494. DOI:10.20506/rst.15.4.987.

11. Poumarat F., Longchambon D., Martel J. L. Application of dot immunobinding on membrane filtration (MF dot) to the study of relationships within “M. mycoides cluster” and within “glucose and arginine-negative cluster” of ruminant mycoplasmas. Vet. Microbiol. 1992; 32 (3–4): 375–90. DOI:10.1016/0378-1135(92)90159-q.

12. Nicholas R., Baker S. Recovery of mycoplasmas from animals. Methods Mol. Biol. 1998; 104: 37–43. DOI:10.1385/0-89603-525-5:37.

13. Hwang M. H., Damte D., Cho M. H., Kim Y. H., Park S. C. Optimization of culture media of pathogenic Mycoplasma hyopneumoniae by a response surface methodology. J. Vet. Sci. 2010; 11 (4): 327–332. DOI:10.4142/jvs.2010.11.4.327.

14. Duta F. P., De França F. P., Sérvulo E. F. C., De Almeida Lopes L. M., Da Costa A. C. A., Barros A. Effect of process parameters on production of a biopolymer by Rhizobium sp. Appl. Biochem. Biotechnol. 2004; 114: 639–652. DOI:10.1385/abab:114:1-3:639.

15. Assunção P., Rosales R. S., Rifatbegović M., Antunes N. T., de la Fe C., Ruiz de Galarreta C. M., Poveda J. B. Quantification of mycoplasmas in broth medium with sybr green-I and flow cytometry. Front. Biosci. 2006; 11: 492–497. DOI:10.2741/1812.

16. Hayflick L. Tissue cultures and mycoplasmas. Tex. Rep. Biol. Med. 1965; 23: Suppl 1:285–303. PMID:5833547.

17. Garcia-Morante B., Dors A., León-Kempis R., Pérez de Rozas A., Segalés J., Sibila M. Assessment of the in vitro growing dynamics and kinetics of the non-pathogenic J and pathogenic 11 and 232 Mycoplasma hyopneumoniae strains. Vet. Res. 2018; 49 (1):45. DOI:10.1186/s13567-018-0541-y.

18. Friis N. F. Some recommendations concerning primary isolation of Mycoplasma suipneumoniae and Mycoplasma flocculare a survey. Nord. Vet. Med. 1975; 27 (6): 337–339. PMID:1098011.

19. Poveda J. B., Nicholas R. Serological identification of mycoplasmas by growth and metabolic inhibition tests. Methods Mol. Biol. 1998; 104: 105–111. DOI:10.1385/0-89603-525-5:105.

20. Calus D., Maes D., Vranckx K., Villareal I., Pasmans F., Haesebrouck F. Validation of ATP luminometry for rapid and accurate titration of Mycoplasma hyopneumoniae in Friis medium and a comparison with the color changing units assay. J. Microbiol. Methods. 2010; 83 (3): 335–340. DOI:10.1016/j.mimet.2010.09.001.

21. Jiang Z., Li S., Zhu C., Zhou R., Leung P. H. M. Mycoplasma pneumoniae infections: Pathogenesis and vaccine development. Pathogens. 2021; 10 (2):119. DOI:10.3390/pathogens10020119.

22. Stemke G. W., Robertson J. A. The growth response of Mycoplasma hyopneumoniae and Mycoplasma flocculare based upon ATP-dependent luminometry. Vet. Microbiol. 1990; 24 (2): 135–142. DOI:10.1016/03781135(90)90061-y.

23. Cook B. S., Beddow J. G., Manso-Silván L., Maglennon G. A., Rycroft A. N. Selective medium for culture of Mycoplasma hyopneumoniae. Vet. Microbiol. 2016; 195: 158–164. DOI:10.1016/j.vetmic.2016.09.022.

24. Friis N. F., Szancer J. Sensitivity of certain porcine and bovine mycoplasmas to antimicrobial agents in a liquid medium test compared to a disc assay. Acta Vet. Scand. 1994; 35 (4): 389–394. DOI:10.1186/BF03548313.