Криоконсервирование первично трипсинизированных клеток фибробластов эмбрионов кур с использованием разных криопротекторов

Криоконсервирование является оптимальным  способом хранения клеток при сверхнизких температурах. Для уменьшения гибели клеток от воздействия низких температур к суспензии клеточной культуры добавляют криопротекторы. Сочетания различных криопротекторов образуют криозащитные среды. В качестве криопротекторов могут быть применены этиленгликоль, глицерин, диметилсульфоксид, сахароза, декстран, пропиленгликоль, альбумин, поливинилпирролидон и сыворотка крови. При проведении работ по криоконсервированию необходимо подобрать криопротектор, обеспечивающий наибольшую выживаемость клеток после хранения и оттаивания. В данной статье представлены результаты экспериментов по сравнению эффективности диметилсульфоксида, этиленгликоля иглицерина при криоконсервировании первично трипсинизированных клеток фибробластов эмбрионов кур. В результате эквилибрации  клеточной суспензии (инкубирования  при комнатной температуре)  с сывороткой и указанными  криопротекторами  разных концентраций для замораживания  были выбраны варианты суспензий, содержащие различные соотношения криопротекторов и сыворотки. Ранее было установлено, что по истечении 12 месяцев наблюдения при использовании в качестве криопротектора диметилсульфоксида наибольшее количество выживших клеток (46%) наблюдалось в суспензии, содержащей 20% фетальной сыворотки и 10% диметилсульфоксида.  Количество выживших клеток при наличии в составе криозащитной смеси 10% фетальной сыворотки и 5% этиленгликоля было несколько ниже и составило 36% по истечении 12 месяцев наблюдения. Было показано, что глицерин обладает слабыми протективными свойствами по отношению к клеткам фибробластов эмбрионов кур. Спустя 8 месяцев хранения количество выживших клеток всуспензии, содержащей 10% сыворотки и 5% глицерина, составило 22%, при последующем хранении живых клеток в данной смеси не выявляли.  Пролиферативные  свойства клеток и чувствительность  их к вирусам сохранялись на протяжении  12 месяцев  эксперимента.

1. Fricano C., Röttinger E., Furla P., Barnay-Verdier S. Cnidarian cell cryopreservation: A powerful tool for cultivation and functional assays. Cells. 2020; 9 (12):2541. DOI: 10.3390/cells9122541.

2. Белая М. М., Красильникова А. А., Пономарева Е. Н. Разработки Южного научного центра РАН в области криоконсервации репродуктивных клеток рыб. Известия Самарского научного центра Российской академии наук. 2018; 20 (5-2): 280–286. eLIBRARY ID: 37118879.

3. Кибалова М. В., Селюкова С. А., Селюков А. Г. Сохранение ценных, редких и исчезающих видов животных. 2. Криоконсервация позвоночных. Вестник Тюменского государственного университета. Экология и природопользование. 2017; 3 (3): 141–157. DOI: 10.21684/2411-7927-2017-3-3-141-157.

4. Кирьянова Г. Ю., Чечеткин А. В., Гришина Г. В., Касьянов А. Д., Красильщикова И. В. Усовершенствованный безаппаратный метод криоконсервирования эритроцитов. Трансфузиология. 2020; 21 (2): 115–128. eLIBRARY ID: 45825626.

5. Okumura N., Kagami T., Watanabe K., Kadoya S., Sato M., Koizumi N. Feasibility of a cryopreservation of cultured human corneal endothelial cells. PLoS One. 2019; 14 (6):e0218431. DOI: 10.1371/journal.pone.0218431.

6. Манин Б. Л. Криоконсервирование и культивирование клеточных линий – две фазы существования биологических объектов. Труды Федерального центра охраны здоровья животных. 2008; 6: 390–405. eLIBRARY ID: 14933114.

7. Курненкова Е. В., Куляшбекова Ш. К. Криоконсервирование клеток, содержащих вирус болезни Марека. Актуальные вопросы зоотехнической науки и практики как основа улучшения продуктивных качеств и здоровья сельскохозяйственных животных: материалы II Международной научно-практической конференции (г. Ставрополь, 22–24 октября 2003 г.). Ставрополь: Агрус; 2003; 349–354. eLIBRARY ID: 25608061.

8. Жуков И. Ю., Шевченко И. В., Власова Н. Н., Варенцова А. А., Манин Б. Л., Пузанкова О. С. и др. Изучение репродукции вируса африканской чумы свиней на первичной культуре клеток костного мозга свиней до и после криоконсервирования. Ветеринария сегодня. 2016; (1): 7–15.

9. Плотникова Э. М., Архарова И. А., Самсонов А. И, Чурина З. Г. Изучение биологических свойств культуры клеток, подвергнутой длительной криоконсервации. Ветеринарный врач. 2018; 2: 7–11. eLIBRARY ID: 32786366.

10. GuanW.,WangD., BaiC., ZhangM., LiC., MaY. Biologicalcharacteristicof an embryonic fibroblast line from Xiaoshan chicken for genetic conservation. JournalofCellandAnimalBiology. 2012; 6 (4): 46–53. DOI: 10.5897/JCAB11.089.

11. Животная клетка в культуре (методы и применение в биотехнологии). Под ред. Л. П. Дьяконова, В. И. Ситькова. М.: Спутник+; 2000. 400 с.

12. Цуцаева А. А., Петренко Т. Ф. Криоконсервация культивируемых клеток животных. В кн.: Методы культивирования клеток: Сборник научных трудов. Ред. Г. П. Пинаев. Л.: Наука; 1988; 63–69.

13. Криоконсервирование клеточных суспензий. Под ред. А. А. Цуцаевой. Киев: Наукова Думка; 1983. 240 с.

14. Greene A. E., Athreya B., Lehr H. B., Coriell L. L. Prolonged storage of cells in dimethyl sulphoxide and glycerol at varying temperatures. Cryobiology. 1967; 3 (5): 383–384. DOI: 10.1016/S0011-2240(67)80115-9.

15. Павлович Е. В., Волкова Н. А., Гольцев А. Н. Криоконсервирование фибробластов человека в присутствии наночастиц золота. Теоретические и практические аспекты современной криобиологии: материалы Международной заочной научно-практической конференции (24 марта 2014 г.). Сыктывкар; 2014; 203–208. Режим доступа: http://physiol.komisc.ru/kriokonf.pdf.

16. Лазарева С. П., Манин Б. Л. Криоконсервирование первично трипсинизированных клеток фибробластов кур. Труды Федерального центра охраны здоровья животных. 2016; 14: 177–192. eLIBRARY ID: 30095812.

17. Старов С. К., Герасимова Н. И., Евсеев А. М., Сарбасов А. Б. Культивирование вакцинного штамма S1133 реовируса птиц в субкультуре клеток куриных фибробластов. Труды Федерального центра охраны здоровья животных. 2005; 3: 400–405. eLIBRARY ID: 24397208.