Разработка метода ОТ-ПЦР в режиме реального времени для выявления РНК вируса гриппа птиц подтипа N2

В настоящее время вирус гриппа птиц подтипа N2 активно циркулирует в популяциях домашних и диких птиц, и его регулярно выявляют в Китае, других странах Азии и России, особенно в комбинации с гемагглютинином подтипа H9. Поэтому применение метода для быстрого обнаружения данного инфекционного агента крайне необходимо. В представленной работе приводятся данные по выбору олигонуклеотидных праймеров и оптимизации условий постановки полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией в режиме реального времени для выявления вируса гриппа птиц подтипа N2. Для амплификации фрагмента гена нейраминидазы подтипа N2 были апробированы предложенные в 2016 году B. Hoffmann праймеры и зонд в модификации, а также выбранные в ходе исследования оригинальные праймеры и зонды с вирусами, имеющимися в рабочей коллекции лаборатории. В ходе работы определены оптимальные концентрации компонентов реакционной смеси для проведения полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией в режиме реального времени и температурно-временной режим. Разные комбинации праймеров тестировали на десяти изолятах вируса гриппа птиц подтипа N2, генетически отличающихся друг от друга по гену N. Девять вирусов выделены от птиц из регионов Российской Федерации и относятся к различным генетическим группам. Специфичность метода проверяли методом полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией в режиме реального времени с использованием изолятов вируса гриппа птиц с другим подтипом нейраминидазы (H5N8, H3N6, H4N6, H5N1, H10N7), а также проб, содержащих РНК вирусов ньюкаслской болезни, инфекционного бронхита кур и инфекционной бурсальной болезни. В результате проведенных исследований были подобраны и оптимизированы условия постановки полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией в режиме реального времени, которые обеспечивают высокую чувствительность и специфичность метода.

вирус гриппа птиц, ОТ-ПЦР-РВ, оптимизация, подтип нейраминидазы N2, чувствительность, специфичность

1. Alexander D. J. Orthomyxovirus infections. In: Virus Infections of Birds. Vol. 3. Ed. by J. B. McFerran, M. S. McNulty. Amsterdam: Elsevier; 1993; 287–316.

2. Штыря Ю. А., Мочалова Л. В., Бовин Н. В. Нейраминидаза вируса гриппа: структура и функция. Acta Naturae. 2009; 1 (2): 28–34. eLIBRARY ID: 15119687.

3. Tong S., Li Y., Rivailler P., Conrardy Ch., Castillo D. A., Chen L.-M., et al. A distinct lineage of influenza A virus from bats. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2012; 109 (11): 4269–4274. DOI: 10.1073/pnas.1116200109.

4. Tong S., Zhu X., Li Y., Shi M., Zhang J., Bourgeois M., et al. New world bats harbor diverse influenza A viruses. PLoS Pathog. 2013; 9 (10):e1003657. DOI: 10.1371/journal.ppat.1003657.

5. Spackman E., Senne D. A., Myers T. J., Bulaga L. L., Garber L. P., Perdue M. L., et al. Development of a real-time reverse transcriptase PCR assay for type A influenza virus and the avian H5 and H7 hemagglutinin subtypes. J. Clin. Microbiol. 2002; 40 (9): 3256–3260. DOI: 10.1128/JCM.40.9.3256-3260.2002.

6. Avian influenza (infection with avian influenza viruses). In: OIE Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals. 7 th еd. Paris, 2018. Chap. 3.03.04. Available at: http://www.oie.int/fileadmin/Home/eng/Health_standards/tahm/3.03.04_AI.pdf.

7. Suarez D. L., Das A., Ellis E. Review of rapid molecular diagnostic tools for avian influenza virus. Avian Dis. 2007; 51 (1 Suppl): 201–208. DOI: 10.1637/7732-101006-REGR.1.

8. Pedersen J. C. Neuraminidase-inhibition assay for the identification of influenza A virus neuraminidase subtype or neuraminidase antibody specificity. Methods Mol. Biol. 2008; 436: 67–75. DOI: 10.1007/978-1-59745279-3_9.

9. Волкова М. А., Чвала Ир. А., Ярославцева П. С., Сосипаторова В. Ю., Осипова О. С., Чвала И А. Серологический мониторинг гриппа птиц в Российской Федерации в 2017–2018 годах. Ветеринария сегодня. 2019; 2 (29): 3–7. DOI: 10.29326/2304-196X-2019-2-29-3-7.

10. Зиняков Н. Г., Осипова О. С., Акшалова П. Б., Сосипаторова В. Ю., Андриясов А. В., Андрейчук Д. Б., Чвала И. А. Анализ генетических свойств изолята вируса гриппа A/chicken/Chelyabinsk/30/2019 H9N2, выделенного на территории Челябинской области. Ветеринария сегодня. 2019; 4 (31): 49–53. DOI: 10.29326/2304-196X-2019-4-31-49-53.

11. Hoffmann B., Hoffmann D., Henritzi D., Beer M., Harder T. C. Riems influenza a typing array (RITA): An RT-qPCR based low-density array for subtyping avian and mammalian influenza a viruses. Sci. Rep. 2016; 6:27211. DOI: 10.1038/srep27211.

12. Андриясов А. В., Андрейчук Д. Б., Чвала И. А. Методические рекомендации по выявлению РНК вируса гриппа птиц типа А методом ОТ-ПЦР в режиме реального времени: утв. ФГБУ «ВНИИЗЖ» 31.05.2016 № 45-16. Владимир: 2016. 13 с.

13. Ребриков Д. В., Саматов Г. А., Трофимов Д. Ю., Семенов П. А., Савилова А. М., Кофиади И. А., Абрамов Д. Д. ПЦР в реальном времени. Под ред. Д. В. Ребрикова. М.: БИНОМ. Лаборатория знаний. 2009. 223 с.