Применение полимеразной цепной реакции для выявления возбудителей некоторых особо опасных вирусных болезней рыб

В настоящее время основной ущерб мировой аквакультуре наносят вирусные болезни рыб. Возбудители болезней часто проникают из одних рыбоводных хозяйств в другие при перевозках инфицированных рыб из неблагополучных хозяйств в благополучные. Поэтому завоз рыбопосадочного материала в Россию из стран с различной эпизоотологической ситуацией требует мониторинга и прогнозирования на основе возможных рисков. Ведущее место в комплексе мероприятий по предотвращению распространения вирусных инфекций рыб занимает диагностика. На сегодняшний день лабораторная диагностика болезней рыб вирусной природы основана на выделении возбудителя и его идентификации серологическими методами, которые требуют больших затрат времени и выполняются только в крупных научно-исследовательских институтах, имеющих профильные лаборатории. Более чувстви­тельными и высокопроизводительными являются молекулярные методы диагностики. В статье представлены результаты применения полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией по выявлению ряда особо опасных вирусных болезней рыб семейства лососевых. В результате проделанной работы были подобраны праймеры и оптимизированы температурно-временные условия проведения реакции для идентификации инфекционного некроза гемопоэтической ткани, вирусной геморрагической септицемии и инфекционной анемии лососевых. Результаты, полученные в ходе иссле­дований, позволили установить, что данный диагностический метод является высокоспецифичным с аналитической чувствительностью для вируса инфекционной анемии лососевых – 2,5 lg ТЦД50/см3, инфекционного некроза гемопоэтической ткани – 2,9 lg ТЦД50/см3 и вирусной геморрагической септицемии – 4,2 lg ТЦД50/см3. С помощью описанного метода была проведена идентификация референтных и полевых штаммов, имеющихся в референтной лаборатории по болезням аквакультуры ФГБУ «ВНИИЗЖ» и выделенных в разные годы в рыбоводческих хозяйствах на территории Российской Федерации. Данные, полученные в ходе исследований, коррелировали с результатами вирусовыделения на культуре клеток и иммуноферментного анализа с использованием коммерческих наборов. Предложенная методика проведения полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией позволяет обнаружить возбудителей болезней у рыб как с явными клиническими признаками, так и со скрытым вирусоносительством.

1. Павлов Д. К., Пичуева А. А. Анализ эпизоотической ситуации в мире по вирусным болезням рыб. Ветеринария сегодня. 2015; 2 (13): 54–58. Режим доступа: https://veterinary.arriah.ru/jour/article/view/196.

2. Завьялова Е. А., Кандрина Н. Ю., Ломакина Н. Ф., Гулюкин М. И. Индикация и идентификация некоторых особо опасных вирусов рыб методом ПЦР. Рыбоводство и рыбное хозяйство. 2015; 3: 21–25. eLIBRARY ID: 23833996.

3. Рахконен Р., Веннерстрем П., Ринтамяки П., Каннел Р. Здоровая рыба – профилактика, диагностика и лечение болезни. 2-е изд., перераб. и доп. Хельсинки: НИИ охотничьего и рыбного хозяйства Финляндии; 2013. 177 с. Режим доступа: https://jukuri.luke.fi/bitstream/handle/10024/537337/Terve%20kala.rus.pdf?sequence=1.

4. Щелканов М. Ю., Шульгина М. А., Степаньков А. П., Львов Д. Н., Какарека Н. Н., Шестопалов А. М., Галкина И. В., Шевченко О. Г. Инфекционная анемия лососевых. Юг России: экология, развитие. 2017; 12 (2): 120–134. DOI: 10.18470/1992-1098-2017-2-120-134.

5. Жигалева О. Н., Колбасова О. Л., Цыбанов С. Ж., Колбасов Д. В., Щелкунов И. С., Щелкунова Т. И. Выявление РНК возбудителя вирусной геморрагической септицемии рыб методом ПЦР. Ветеринария. 2006; 9: 24–26. eLIBRARY ID: 9242745.

6. Devold M., Krossøy B., Aspehaug V., Nylund A. Use of RT-PCR for diagnosis of infectious salmon anaemia virus (ISAV) in carrier sea trout Salmo trutta after experimental infection. Dis. Aquat. Organ. 2000; 40 (1): 9–18. DOI: 10.3354/dao040009.

7. Emmenegger E. J., Meyers T. R., Burton T. O., Kurath G. Genetic diversity and epidemiology of infectious hematopoietic necrosis virus in Alaska. Dis. Aquat. Organ. 2000; 40 (3): 163–176. DOI: 10.3354/dao040163.

8. Viral haemorrhagic septicaemia. In: Manual of Diagnostic Tests for Aquatic Animals. OIE. 2019. Available at: https://www.oie.int/fileadmin/Home/eng/Health_standards/aahm/current/chapitre_vhs.pdf.

9. Доронин М. И., Котова Е. В., Никитин М. М. Мудрак Н. С. Одновременная идентификация вирусов лососевых рыб с помощью метода обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (ОТ-ПЦР-РВ) в формате микрочипов. Молекулярная диагностика 2017: сборник трудов IX Всероссийской научно-практической конференции с международным участием. Под ред. В. И. Покровского. Т. 2. Тамбов: ООО «Фирма Юлис», 2017; 367–368. Режим доступа: https://kpfu.ru/staff_files/F1634184337/Tom_2_s_oblozhkoj.pdf.

10. Попова А. Г., Орешкова С. Ф., Щелкунов И. С., Рудакова С. Л., Щелкунова Т. И., Тикунова Н. В., Блинова Н. Н., Ильичев А. А. Методы идентификации и типирования вируса инфекционного некроза гемопоэтической ткани лососевых рыб на основе ОТ-ПЦР. Вопросы вирусологии. 2008; 53 (3): 39–43. eLIBRARY ID: 11519442.

11. Rudakova S. L., Kurath G., Bochkova E. V. Occurrence and genetic typing of infectious hematopoietic necrosis virus in Kamchatka, Russia. Dis. Aquat. Organ. 2007; 75 (1): 1–11. DOI: 10.3354/dao075001.

12. Einer-Jensen K., Ahrens P., Lorenzen N. Parallel phylogenetic analyses using the N, G or Nv gene from a fixed group of VHSV isolates reveal the same overall genetic typing. Dis. Aquat. Organ. 2005; 67 (1–2): 39–45. DOI: 10.3354/dao067039.

13. Johansson T., Einer-Jensen K., Batts W., Ahrens P., Björkblom C., Kurath G., Björklund H., Lorenzen N. Genetic and serological typing of European infectious hematopoietic necrosis virus (IHNV) isolates. Dis. Aquat. Organ. 2009; 86 (3): 213–221. DOI: 10.3354/dao02108.

14. Kibenge M. J., Iwamoto T., Wang Y., Morton A., Routledge R., Kibenge F. S. Discovery of variant infectious salmon anaemia virus (ISAV) of European genotype in British Columbia, Canada. Virol. J. 2016; 13:3. DOI: 10.1186/s12985-015-0459-1.