Биоцидный эффект нового дезинфицирующего препарата в отношении изолятов микроорганизмов

ВВЕДЕНИЕ

Производство животноводческой продукции является важной составной частью сельскохозяйственной отрасли во многих странах мира. Особенно интенсивно промышленное животноводство развивается в последнее десятилетие, и в настоящее время оно по праву считается наиболее динамичной и наукоемкой отраслью мирового агропромышленного производства. Стабильная экономическая ситуация животноводческих предприятий является обязательным требованием, предъявляемым к ним. Это требование может быть выполнено только в том случае, если на фермах будет находиться здоровое поголовье животных [1][2][3].

Концентрация в хозяйстве большого количества животноводческих построек, увеличение их размера, скученность животных, быстрая смена популяций благоприятствуют распространению инфекционных заболеваний, которые могут сопровождаться высокой смертностью и снижением продуктивности [4][5].

Для достижения высоких показателей производства важно постоянно поддерживать необходимый уровень санитарно-гигиенического состояния животноводческих комплексов, который достигается с помощью комбинированной очистки всех поверхностей помещений (потолок, стены, пол), оборудования и инвентаря с обязательной последующей дезинфекцией [6][7].

На животноводческих предприятиях дезинфекция является неотъемлемой частью технологического процесса, направленного на обеспечение безопасности в биологическом отношении продуктов животноводства. Все чаще стали возникать инфекции, которые имели широкое распространение в Советском Союзе: бруцеллез, туберкулез, сибирская язва и др., в случае их заноса на убой может отправиться большая часть поголовья крупного животноводческого комплекса [8][9].

Эффективность дезинфекции во многом зависит от комплексности ее проведения. Осуществление полного комплекса дезинфекционных мероприятий необходимо предусматривать уже на этапе проектирования объектов животноводства. В проектах должны быть обязательно предусмотрены оборудованные соответствующим образом помещения для мойки и дезинфекции всех видов транспортных средств и приспособлений, используемых в животноводстве. На предприятиях ветеринарного надзора дезинфекцию обязательно включают в план противоэпизоотических мероприятий по каждой ферме и хозяйству в целом [10][11].

Резистентность патогенной микрофлоры к дезинфицирующим веществам пока еще не получила широкого распространения. Тем не менее существует высокая вероятность возникновения устойчивых штаммов патогенных микроорганизмов в случае неправильного использования дезинфицирующих средств. Исследования показали, что даже кратковременное воздействие дезинфицирующими веществами на многие бактерии в концентрациях, недостаточных для гибели, вызывает их мутацию, при этом могут формироваться патогенные микроорганизмы, устойчивые к действию дезсредств [12][13].

Особой устойчивостью к дезинфектантам обладают бактериальные споры благодаря наличию многокомпонентной клеточной стенки, с помощью которой они выдерживают концентрацию дезинфицирующих веществ, превышающих на несколько порядков концентрацию для уничтожения вегетативных клеток. Возбудитель туберкулеза крупного рогатого скота Mycobacterium bovis обладает высокой резистентностью к действию многих дезинфектантов, имеющих в составе в качестве действующих веществ спирты, кислоты, щелочи [14][15].

Загрязнения на обрабатываемых объектах оказывают негативное воздействие на обеззараживающий эффект. Находящиеся на них частицы корма, выделения животных являются защитным субстратом для микробной клетки и могут тем самым не допускать диффузию дезинфектанта через клеточную стенку. Различные строительные материалы, применяемые при возведении животноводческих комплексов, могут поглощать дезинфицирующие растворы, увеличивая их расход [16][17].

Широкое распространение технологического оборудования в животноводческой отрасли создает потребность в эффективных методах его санитарной обработки. Процессы, связанные с мойкой и дезинфекцией различных объектов в хозяйствах, занимают до 25% всего рабочего времени. Данные важнейшие мероприятия зачастую могут игнорироваться, что в итоге приводит к снижению объема качественной продукции животноводства [18][19].

Перспективным направлением для обеззараживания является применение средств, обладающих симультанным эффектом благодаря введению в их рецептуру различных поверхностно-активных веществ для придания моющего эффекта бактерицидам. Это позволяет проводить одновременно мойку и дезинфекцию, что значительно экономит время и трудозатраты за счет сокращения санитарной обработки [20][21].

Поверхностно-активные вещества применяют в качестве смачивателей, растекателей, эмульгаторов, они хорошо смачивают обрабатываемые объекты за счет снижения поверхностного натяжения растворов, что обеспечивает быстрый контакт дезинфицирующих препаратов с микробной клеткой [22][23].

Немаловажной проблемой является форма существования бактерий в естественных условиях в виде биопленок. Матрикс биопленки способен препятствовать скорости диффузии некоторых антибиотиков и других биоцидных препаратов. Такое сообщество (популяция) обладает громадными способностями к сопротивлению стрессовым факторам, биоциды в дозах, эффективных в отношении взвеси микробных клеток, не эффективны в отношении биопленок микроорганизмов [24][25]. Поэтому актуальной задачей становится разработка и внедрение новых комплексных дезинфицирующих препаратов, что позволит на высоком уровне обеспечивать биологическую безопасность агропромышленного комплекса [26].

Новизна данной работы заключается в анализе биоцидного эффекта нового дезинфицирующего препарата в отношении микроорганизмов различных групп устойчивости к химическим дезинфицирующим препаратам в условиях, имитирующих производственную среду помещений, предназначенных для содержания крупного рогатого скота.

Цель исследования – изучить биоцидный эффект нового дезинфицирующего препарата в отношении микрофлоры, относящейся к разным группам резистентности к химическим дезинфицирующим препаратам, в условиях, имитирующих производственную среду животноводческих помещений.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Характеристика исследуемого объекта. Дезинфицирующий препарат, созданный в ФГБНУ «Омский аграрный научный центр», представляет собой жидкий вязкий концентрат темно-зеленого цвета, хорошо диффундирующий в воде. Действующими веществами (биоцидами) являются четвертичные аммониевые соединения (12%) и альдегиды (8%). Для придания моющих свойств в рецептуру препарата введены неионогенные высокомолекулярные поверхностно-активные вещества. Биоцидный эффект препарата изучали на идентифицированных изолятах микрофлоры, выделенных из проб, взятых с поверхностей помещений, в которых содержался крупный рогатый скот. Полученные изоляты микроорганизмов относились к следующим группам резистентности к химическим дезинфицирующим препаратам: микрофлора, малорезистентная к дезинфектантам: Escherichia coli, Klebsiella aerogenes, Citrobacter freundii, Hafnia alvei, Aeromonas hydrophila, Proteus mirabilis и Enterococcus faecalis; микрофлора, резистентная к дезпрепаратам: Staphylococcus lentus, Staphylococcus capitis и Staphylococcus intermedius; микрофлора, особо резистентная к дезинфектантам: Bacillus cereus.

Биоцидный эффект оценивали, обрабатывая препаратом тест-объекты, изготовленные из батиста (хлопчатобумажная ткань), с защитным субстратом и без него, а также строительные материалы размером 100 см², используемые при возведении помещений животноводческих комплексов: кафельная плитка – гладкий строительный материал; бетон – пористый, неровный материал, хорошо адсорбирующий влагу, с применением защитного субстрата. В качестве защитного субстрата (для имитации производственных условий) использовали инактивированную сыворотку крови крупного рогатого скота. В контрольном исследовании тест-объекты и строительные поверхности обрабатывались стерильной дистиллированной водой.

Опыты осуществляли при температуре (18 ± 2) °C.

Биоцидный эффект изучали в соответствии с методическим руководством Р 4.2.3676-20¹.

Этапы проведения исследования.

1. Изготовление батистовых тест-объектов. Кусок хлопчатобумажной ткани погружали на сутки в емкость с холодной водопроводной водой для растворения крахмала. После чего происходила его тщательная отмывка с поверхностно-активными веществами, кипячение и сушка в сухожаровом шкафу. Далее батист разрезали на тест-объекты, помещали в стерильную посуду и подвергали стерилизации.
2. Внесение тест-объектов в суспензию микрофлоры, содержащую 2 × 10⁹ КОЕ/мл, и добавление к ней защитного субстрата.
3. Обработка тест-объектов в испытуемых рабочих растворах дезинфицирующего препарата следующих концентраций: 0,5; 1,0; 2,0; 3,0; 4,0; 5,0% – при экспозиции 30, 45, 60, 120 и 180 мин.
4. Нейтрализация дезинфицирующего раствора после воздействия в заданных концентрациях и экспозициях: погружение тест-объектов в нейтрализатор, содержащий Твин 80 (3%), сапонин (0,3–3,0%), гистидин (0,1%), цистеин (0,1%).
5. Инкубирование нейтрализованных тест-объектов на поверхности плотной питательной среды (мясо-пептонный агар) в термостате при температуре 37 °С.

Деконтаминация строительных материалов.

1. Обсеменение строительных материалов суспензией микрофлоры, содержащей 2 × 10⁹ КОЕ/мл, в объеме 1 мл на каждый объект площадью 100 см².
2. Добавление к суспензии 2 мл защитного субстрата.
3. Обеззараживание строительных материалов влажным методом следующими концентрациями дезинфицирующего препарата: 1,0; 2,0; 3,0; 5,0; 6,0% – при экспозиции 30, 45, 60, 120 и 180 мин. Расход препарата составил 250 мл/м² при воздействии на кафельную плитку и 400 мл/м² – на бетон.
4. Отбор проб стерильными тампонами со строительных материалов после каждого воздействия препарата, посев на питательные среды и инкубирование в термостате при температуре 37 °С.

Все результаты оценивали следующим образом: рост микрофлоры на питательных средах – дезинфицирующий препарат неэффективен; отсутствие роста микрофлоры – наличие дезинфицирующих свойств.

Микробиологические исследования проводили при помощи бокса биологической безопасности II класса защиты.

Статистическая обработка результатов велась с использованием программы Microsoft Excel.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Анализ полученных результатов позволяет установить наличие биоцидного эффекта у исследуемого дез-инфицирующего средства в отношении микрофлоры, относящейся к следующим группам резистентности к химическим дезинфицирующим препаратам: малорезистентные, резистентные и особо резистентные микроорганизмы. При проведении опытов на батистовых тест-объектах (без использования защитного субстрата) отмечена высокая эффективность рабочих растворов нового препарата в концентрациях от 0,5 до 3,0%. Биоцидный эффект испытуемого дезсредства в отношении малорезистентной к дезинфектантам микрофлоры был достигнут: для E. сoli, C. freundii, H. аlvei, A. hydrophila – при обработке тест-объектов 0,5%-м раствором при 60-минутной выдержке; для K. аerogenes, P. mirabilis, E. faecalis – после применения аналогичной концентрации и 120-минутной экспозиции. Эффективным режимом для обеззараживания микрофлоры, резистентной к дезинфектантам (S. lentus, S. capitis, S. intermedius), являлось 120-минутное воздействие 1,0%-м раствором препарата.

Санация тест-объектов, обсемененных особо резистентной к дезинфектантам микрофлорой (B. сereus), была эффективной после обработки 3,0%-м раствором нового дезсредства в течение 180 мин (табл. 1).

В экспериментах по изучению биоцидного эффекта с использованием защитного субстрата получены следующие результаты: в отношении малорезистентных к дезинфектантам E. сoli, C. freundii, H. аlvei, A. hydrophila и K. аerogenes бактерицидное действие наблюдалось после выдержки в 1,0%-м растворе препарата в течение 120 мин; тест-объекты, контаминированные P. mirabilis и E. faecalis, обеспложивались воздействием аналогичной концентрации при 180-минутной экспозиции. Рабочий раствор нового дезинфектанта в режиме применения 2,0% / 120 мин был эффективен в отношении S. lentus, S. capitis, S. intermedius, относящихся к группе резистентных.

Особо резистентная микрофлора (B. сereus) проявляла чувствительность к исследуемому препарату при обработке в концентрации 5,0% в течение 120 мин (табл. 2).

Обеззараживание кафельной плитки, обсемененной микрофлорой, входящей в группу малорезистентных к дез-инфектантам, обеспечивал режим применения препарата 1,0% / 180 мин; в отношении S. lentus, S. capitis и S. intermedius из группы резистентных к дезинфектантам биоцидный эффект отмечен для 2,0%-й концентрации при 120-минутной выдержке; особо резистентная к дезинфектантам B. сereus проявляла чувствительность к действию препарата в режиме 5,0% / 120 мин (табл. 3).

На бетонной поверхности, обсемененной микроорганизмами из группы малорезистентных к дезинфектантам, препарат эффективно воздействовал в режиме применения 2,0% / 180 мин; биоцидный эффект в отношении микрофлоры, резистентной к дезинфектантам (S. lentus, S. capitis и S. intermedius), проявлялся при использовании препарата в концентрации 3,0% и времени экспозиции 180 мин; деконтаминация бетона от особо резистентной B. cereus отмечена после двукратной обработки 6,0%-м раствором препарата и 240-минутной экспозиции с интервалом 120 мин (табл. 4).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

По результатам проведенных экспериментов, имитирующих условия производственной среды животноводческих помещений (с использованием защитного субстрата и строительных материалов, применяемых при возведении помещений животноводческих комплексов), установлено наличие биоцидного эффекта у нового дезинфицирующего препарата в отношении микроорганизмов разных групп резистентности к химическим дезинфицирующим средствам.

Биоцидное действие против микрофлоры, малорезистентной к дезинфектантам, при тестировании на батистовых объектах наблюдалось после использования режима 1,0% / 180 мин; режим применения 2,0% / 120 мин был эффективен в отношении микроорганизмов из группы резистентных к дезинфектантам; особо резистентная микрофлора проявляла чувствительность к исследуемому препарату в режиме 5,0% /120 мин.

Обеззараживание кафельной плитки – гладкого строительного материала, не адсорбирующего раствор дезинфицирующего средства, – обсемененной микрофлорой, входящей в группу малорезистентных к дезинфектантам, обеспечивал режим применения препарата 1,0% / 180 мин; в отношении резистентной к дезинфектантам микрофлоры биоцидный эффект отмечен при обработке 2,0%-м раствором при 120-минутной выдержке; особо резистентная к дезинфектантам B. сereus проявляла чувствительность к препарату, используемому в режиме 5,0% / 120 мин.

При санации изучаемым препаратом тест-поверхности из бетона, обсемененной малорезистентной к дезинфектантам микрофлорой, его эффективность была достигнута при воздействии 2,0%-го раствора и выдержке в течение 180 мин; биоцидное действие в отношении микрофлоры, резистентной к дезинфектантам, оказывал препарат в режиме 3,0% / 180 мин; отсутствие роста особо резистентной B. cereus было зафиксировано после двукратной обработки 6,0%-м раствором препарата и 240-минутной экспозиции с интервалом 120 мин.

Анализируя полученные данные, можно сделать вывод о дальнейшей целесообразности проведения экспериментов в производственных условиях животноводчес-ких комплексов, в том числе в осенне-зимне-весенний период, для оценки дезинфицирующего действия нового препарата при пониженной температуре в целях разработки эффективных режимов обеззараживания производственных объектов агропромышленного комплекса.

Вклад авторов: Аржаков П. В. – формирование идеи, изучение биоцидного эффекта, анализ полученных данных, редактирование текста статьи; Дудоладова Т. С. – научное консультирование, изучение биоцидного эффекта, редактирование текста статьи; Новиков А. Н. – составление плана исследований, подготовка текста статьи.

Contribution of the authors: Arzhakov P. V. – concept development, biocidal effect study, data analysis, article editing; Dudoladova T. S. – scientific consulting, biocidal effect study, article editing; Novikov A. N. – research plan development, article preparation.