Оценка иммуногенного действия вакцин против ньюкаслской болезни

ВВЕДЕНИЕ

Ньюкаслская болезнь (НБ) представляет собой высококонтагиозное вирусное заболевание, которое поражает различные виды птиц в зависимости от степени их восприимчивости [1] и наносит огромный экономический ущерб птицеводческой отрасли [2].

Первые случаи НБ птиц были зафиксированы в 1926 г. в Индонезии и в 1927 г. в Ньюкасл-апон-Тайне (Англия) [3]. С тех пор о крупных вспышках НБ сообщалось во многих странах, включая Корею, Филиппины, Индию, Шри-Ланку и Японию [4].

Клинические признаки болезни нередко отличаются в зависимости от вида птицы и конкретного штамма возбудителя. Известно, что куры крайне восприимчивы, в то время как утки и гуси менее подвержены действию вируса [5]. Возбудитель способен поражать более 236 видов птиц, относящихся как минимум к 20 отрядам, при этом могут быть инфицированы как домашние, так и дикие птицы [6][7]. У домашней птицы характерными симптомами являются потеря аппетита, угнетение, аномальная жажда, слабость, отеки и снижение яйценоскости; респираторные проявления могут включать чихание, затрудненное дыхание, выделения из носа и кашель, в то время как явным кишечным симптомом является диарея с пометом зеленоватого цвета [8]. К поражениям нервной системы относятся кривошея, парезы, параличи, атаксия, а также тремор головы и конечностей. При остром течении НБ смерть наступает внезапно, птицы могут погибать без каких-либо клинических признаков [8].

Возбудителем болезни является представитель рода Orthoavulavirus подсемейства Avulavirinae семейства Paramyxoviridae [2]. Это оболочечный вирус, генетический материал которого представлен несегментированной негативно-смысловой одноцепочечной молекулой РНК длиной приблизительно 15 000 нуклеотидов [9][10]. Ключевым фактором патогенности возбудителя ньюкаслской болезни является образование активных слитых белков F1 и F2 при расщеплении предшественника F-белка (F0), а также наличие некоторых основных остатков в месте расщепления слитого белка (FPCS) [11].

С момента своего появления вирус НБ птиц претерпел заметную эволюцию, что проявилось в значительном генетическом, вирулентном и антигенном разнообразии, а также в расширении ареала распространения [12]. Филогенетический анализ последовательности гена белка F позволяет разделить штаммы вируса НБ на два класса [13]. Класс I включает преимущественно авирулентные штаммы вируса, природным резервуаром которых являются водоплавающие дикие птицы, в то время как к классу II относятся варианты вируса с более высокой генетической изменчивостью и вирулентностью по меньшей мере 20 генотипов, которые инфицируют различные виды домашних и диких птиц [14]. Кроме того, штаммы вируса класса II считаются ответственными за большинство вспышек НБ, о которых известно на сегодняшний день [15]. Генотипы II, III и IV были ответственны за первые эпизоотии НБ, которые произошли с 1920 по 1960 г., а субгенотип VIb (субгенотип VI.1.1, согласно современной классификации) привел к третьей панзоотии среди голубей в 1980-х гг. [16]. Генотип VII, в свою очередь, вызвал четвертую панзоотию НБ, охватившую Азию, Африку, Европу и Южную Америку [2], и пятую, последнюю на данный момент, панзоотию [16]. Варианты вируса НБ генотипа VII считаются наиболее быстро эволюционирующими в пределах своего класса [17], а их высокая вирулентность и способность вызывать болезнь даже у водоплавающих птиц оправданно вызывает беспокойство в мировом сообществе [18].

Поскольку эффективность каких-либо лекарственных препаратов в лечении ньюкаслской болезни птиц не доказана, единственным способом защиты стада является профилактика, которая достигается путем соблюдения мер биозащиты и вакцинации [19].

На коммерческих птицефабриках основными биологическими рисками являются неправильная утилизация мертвой птицы и неполное обеззараживание помета, совместное содержание разновозрастного и многовидового поголовья птицы, а также ненадлежащий контроль за перемещениями и санитарией на птицефабрике [20]. В связи с этим основным направлением биозащиты является минимизация контакта домашней птицы, кормов, воды и рабочего инвентаря с любыми факторами, расположенными за пределами птицефабрики, особенно с дикими птицами.

Вакцинация лежит в основе стратегии борьбы с ньюкаслской болезнью и защиты популяций домашних птиц в эндемичных регионах [21]. Наиболее часто используемые вакцины против НБ разработаны на основе живых или инактивированных штаммов вируса, выделенных в прошлом веке, включая штаммы LaSota, B1, Ulster/67, Mukteswar и VG/GA [22]. Хотя современные вакцины при должном применении могут предотвратить вспышку болезни и гибель поголовья, они не всегда препятствуют распространению вируса [23]. Потенциальное антигенное несоответствие между вакцинными и полевыми штаммами способно отразиться на эффективности иммунопрофилактики. В этих условиях полевые изоляты вируса все еще могут распространяться среди птиц и вызывать атипичное течение болезни [24]. Имеющиеся данные свидетельствуют о том, что вакцины на основе циркулирующих штаммов демонстрируют более высокий уровень защиты [25] и способствуют снижению выделения вируса по сравнению с вакцинами, изготовленными из штаммов, сильно отличающихся от полевых [24]. Также сообщалось, что значительная генетическая разница между циркулирующими в настоящее время полевыми изолятами генотипа VII и вакцинными штаммами генотипа I или II играет критическую роль в частой подверженности птицефабрик вспышкам НБ, обусловленным вирулентным вирусом, несмотря на применяемые стратегии вакцинации [26].

Вышеуказанные данные подчеркивают необходимость усовершенствования мер специфической профилактики ньюкаслской болезни, в частности актуализации производственных вакцинных штаммов вируса НБ. Целью исследования являлось изучение иммуногенной активности моновалентной вакцины на основе традиционно применяемого антигена вируса НБ генотипа II, а также вакцин «ВНИИЗЖ-АвиНью Мульти» и «ВНИИЗЖ-АвиНьюФлу Мульти», изготовленных с использованием антигенов вируса НБ II и VII генотипов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Объекты исследования:

1) вакцина против ньюкаслской болезни инактивированная эмульсионная (далее – «НБ-Ла-Сота»); активный компонент – антиген вируса НБ штамма «Ла-Сота» в составе экстраэмбриональной жидкости (ЭЭЖ) инфицированных эмбрионов кур;

2) вакцина против ньюкаслской болезни инактивированная эмульсионная «ВНИИЗЖ-АвиНью Мульти»; активный компонент – антиген вируса НБ, состоящий из смеси штаммов «Ла-Сота» и «ВНИИЗЖ G7» в составе ЭЭЖ инфицированных эмбрионов кур;

3) вакцина против ньюкаслской болезни («G7» и «Ла-Сота») и гриппа птиц H9N2 (Y280 и G1) ассоциированная инактивированная эмульсионная «ВНИИЗЖ-АвиНьюФлу Мульти»; активный компонент – антиген вируса НБ, состоящий из смеси штаммов «Ла-Сота» и «ВНИИЗЖ G7» в составе ЭЭЖ инфицированных эмбрионов кур.

Производственные штаммы вирусов. В эксперименте использовали:

– штамм «ВНИИЗЖ G7» вируса НБ генотипа VII субгенотипа VII.1.1. (далее – «ВНИИЗЖ G7»);

– штамм «Ла-Сота» вируса НБ генотипа II (далее – «Ла-Сота»);

– штамм «A/chicken/Amursky/03/12/H9N2» вируса низкопатогенного гриппа птиц подтипа H9N2;

– штамм «Челябинск-20» вируса низкопатогенного гриппа птиц подтипа H9N2.

Вирусы инактивировали аминоэтилэтиленимином (0,25%). Специфическая активность полученных антигенов вируса НБ составила: 7 log₂ (1:128) ГАЕ – для «ВНИИЗЖ G7» и 10 log₂ (1:1024) ГАЕ – для «Ла-Сота». Специфическая инфекционная активность вирусов до инактивации: 9,0 ЭИД₅₀/см³ – для «ВНИИЗЖ G7»; 10,5 ЭИД₅₀/см³ – для «Ла-Сота».

Получение разведений вакцин с заданной концентрацией антигена. В качестве исходного антигена вируса НБ для изготовления вакцины «НБ-Ла-Сота» использовали цельный (неразведенный) антиген штамма «Ла-Сота», а для изготовления вакцин «ВНИИЗЖ-АвиНью Мульти» и «ВНИИЗЖ-АвиНьюФлу Мульти» – смесь антигенов штаммов «Ла-Сота» и «ВНИИЗЖ G7» в равном соотношении. Концентрации антигенов (D) в прививном объеме вакцин регулировали путем разведения исходных препаратов соответствующих антигенов физиологическим раствором в соотношениях 1:25, 1:50 и 1:100, а также применяли неразведенные антигены.

Далее полученные препараты антигенов эмульгировали в соотношении 30:70 в масляном адъюванте Coralvac RZ 528 (Турция).

При изготовлении разведений вакцины «ВНИИЗЖ-АвиНьюФлу Мульти» использовали также антигены вируса низкопатогенного гриппа птиц подтипа H9N2 (штаммы «A/chicken/Amursky/03/12/H9N2» и «Челябинск-20»).

Указанные антигены вирусов НБ и гриппа птиц использовали в соотношении 1:1, при этом количество антигенов разных штаммов было в равных пропорциях.

Смешивание с разбавителем производили в лабораторном гомогенизаторе тканей при 6000 оборотов в течение 10 мин. Стабильность полученной эмульсии оценивали центрифугированием при 1000 g в течение 10 мин. Эмульсию считали стабильной, если отслоение легкой (масляной) фракции не превышало 5% по объему, а отслоения тяжелой (водной) фракции не происходило.

Птица. Исследование проводили на 4-недельных цыплятах яичного кросса Ломан Браун из хозяйства, благополучного по острым инфекционным болезням, серонегативных к вирусу НБ. Отсутствие специфических антител к вирусу НБ подтверждали путем исследования сывороток крови, полученных до заражения птиц, в реакции торможения гемагглютинации (РТГА).

Иммунизация птиц. Каждый образец вакцины с заданной концентрацией антигена был испытан на отдельной группе птиц численностью 10 гол. Препарат вводили внутримышечно в область груди в объеме 0,5 см³. Дополнительно была образована группа контроля вируса (10 гол.), в которой иммунизацию не проводили (интактные птицы). Опытные группы формировались в соответствии с «Правилами регулирования обращения ветеринарных лекарственных средств на таможенной территории Евразийского экономического союза» (утверждены решением Совета Евразийской экономической комиссии от 21.01.2022 № 1)¹. Птиц содержали группами в изолированных настольных боксах с автономной вентиляцией, подачей воды и корма.

Реакция гемагглютинации (РГА). Пробы антигенсодержащих материалов исследовали в РГА в соответствии с методикой, изложенной в Руководстве по диагностическим тестам и вакцинам для наземных животных Всемирной организации здравоохранения животных (Руководство ВОЗЖ)². Определяли титр гемагглютинирующих единиц (ГАЕ).

Реакция торможения гемагглютинации (РТГА). C помощью РТГА в сыворотках крови, полученных от птиц через 28 сут после вакцинации, определяли титр антител к вирусу НБ, используя диагностические наборы производства ФГБУ «ВНИИЗЖ», в соответствии с «Методическими рекомендациями по идентификации вирусов гриппа птиц и ньюкаслской болезни в реакции торможения гемагглютинации»³.

Заражение птиц. В группах иммунизированных и интактных птиц проводили контрольное заражение через 28 сут после вакцинации, для чего использовали вирулентный изолят вируса НБ NDV/chicken/rus/Saratov/2403-3/22. Вирусный материал вводили в дозе 6,0 lgЭИД₅₀/0,5 см³ внутримышечно в область бедра.

В течение последующих 10 сут оценивали состояние зараженной и контактной птицы согласно ГОСТ Р 58090-2018 «Клиническое обследование непродуктивных животных. Общие требования»⁴. Проводили ежедневное наблюдение за клиническим состоянием опытных птиц с фиксацией фаз течения болезни, различных проявлений и признаков болезни, а также гибели.

По окончании срока наблюдений в группах определяли суммарное число клинически больных и павших птиц, зафиксированное за период опыта (∑c), на основании которого вычисляли протективные индексы (Pr) по формуле:

Pr = 1 – (∑c) / n,

где n – количество птиц в группе до заражения.

Все эксперименты на животных проводились в строгом соответствии с межгосударственным стандартом по содержанию и уходу за лабораторными животными ГОСТ 33215-2014, принятым Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации, а также согласно требованиям Директивы 2010/63/EU Европейского парламента и Совета Европейского союза от 22.09.2010 по охране животных, используемых в научных целях. Исследования одобрены комиссией по биоэтике ФГБУ «ВНИИЗЖ» (заключение от 26.09.2025).

Показатели напряженности поствакцинального иммунитета. Оценками напряженности поствакцинального гуморального иммунитета к вирусу НБ служили установленные в РТГА средние логарифмические титры антител к вирусу НБ (Т). Для постановки реакции параллельно использовали антигены «ВНИИЗЖ G7» и «Ла-Сота». Результаты клинических наблюдений в группах после контрольного заражения выражали в виде клинических показателей и индексов защиты.

Обработка экспериментальных данных. Использовали общепринятые способы обработки выборок варьирующих переменных (определяли средние значения, стандартные отклонения и стандартные ошибки средних). Применяли регрессионный анализ [27]. Для приближения зависимости между величинами к линейному виду значения D (величина разведения антигена) логарифмировали (lgD), при этом оценки Pr преобразовывали в линейные эквиваленты. Линейные эквиваленты вычисляли с помощью логит-преобразования по Берксону [28]. Для эмпирических значений Р = 1 использовали условные оценки:

‘Р₁ = 1 – (1 / 5n) [29].

Расчет величины 50%-й протективной дозы (PD₅₀) выполняли по формуле:

lgPD₅₀ = b / (–k),

где b – свободный член регрессионного уравнения (ордината линии регрессии);

k – регрессионный коэффициент.

Статистическую неопределенность показателя lgPD₅₀ [30] указывали в виде стандартной ошибки измерения (±S).

За величину PD₅₀, согласно Руководству ВОЗЖ, принимали протективный эффект вакцины в разведении, при котором наблюдается 50%-я защита животных. Вакцину считали соответствующей стандарту, если значение PD₅₀ составляло не менее 50 на дозу и если нижний доверительный предел был не менее 35 PD₅₀ на дозу⁵.

Вычислительные операции и графические построения выполняли в приложении Excel.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

В ходе проведенного эксперимента было установлено, что исследуемые вакцины против ньюкаслской болезни птиц обладают различными иммуногенными свойствами в отношении вирулентного изолята вируса НБ генотипа VII. В таблице 1 представлены первичные данные по изучению протективной активности вакцин против НБ. Даны разведения антигена в прививном объеме вакцины, испытанные на группах из n-числа птиц, протективные индексы (Pr) и соответствующие им линейные эквиваленты (Y).

Соответственно тестируемым препаратам исследовали зависимость значений эквивалентов (Y) от величин испытанных прививных доз антигенов (D). Построили регрессионные модели, объективно отражающие связь исследуемых параметров с учетом общей статистики всех первичных данных, и определяли показатели PD₅₀, характеризующие протективные потенциалы тестируемых вакцин.

Результаты регрессионного анализа в графическом виде представлены на рисунке.

Как видно, уравнения (регрессионные модели) имели высокий уровень адекватности (R² > 0,8), что позволяло использовать их для дальнейшего вычисления концентрации 50%-х протективных доз (PD₅₀), которые при данных условиях испытаний содержались в прививном объеме тестируемых препаратов, равном 0,5 см³. Полученные результаты представлены в таблице 2.

В эксперименте по оценке протективного эффекта вакцин против заражения высоковирулентным изолятом NDV/chicken/rus/Saratov/2403-3/22 установлено, что наибольшим протективным потенциалом обладал препарат «ВНИИЗЖ-АвиНью Мульти», который в прививном объеме содержал 164 PD₅₀/0,5 см³. Следующим по данному показателю был препарат «ВНИИЗЖ-АвиНьюФлу Мульти», содержавший 127 PD₅₀/0,5 см³. Вакцина «НБ-Ла-Сота» имела наименьшую оценку, которая составила 81 PD₅₀/0,5 см³.

Далее проводили серологические исследования. В РТГА определяли титры антител к вирусу НБ (T), установленные в пробах сыворотки крови птиц через 28 сут после иммунизации. Анализировали связь значений титров и заданных прививных доз антигенов и сравнивали значения титров, полученных в гомо- (hom) и гетерологичных (het) реакциях. Соответствующие результаты приведены в таблице 3.

Исходя из полученных данных можно заключить, что напряженность поствакцинального гуморального иммунитета зависела от концентрации антигена в прививном объеме вакцины. Значения титров антител в группах цыплят, привитых цельным антигеном в составе вакцины, были в пределах от 6,4 до 10,0 log₂. Также было отмечено, что титры антител в РТГА несколько различались при постановке реакции с различными антигенами. Наибольшие титры антител к антигену «Ла-Сота» выявляли в группах цыплят, привитых вакцинами «ВНИИЗЖ-АвиНью Мульти» и «НБ-Ла-Сота»: (9,30 ± 0,11) и (9,30 ± 0,10) log₂ соответственно. Наиболее высокие титры антител к антигену «ВНИИЗЖ G7» выявляли после вакцинации «ВНИИЗЖ-АвиНью Мульти».

Кроме того, установили, что значение титров пост-вакцинальных антител в гомологичных реакциях (log₂ T_hom) превышали аналогичные показатели в гетерологичных реакциях (log₂ T_het), что указывало на меньшую эффективность образования иммунных комплексов в гетерологичной системе.

Таким образом, на основании результатов контрольного заражения и результатов оценки гуморального иммунитета установили, что все вакцины соответствовали требованиям ВОЗЖ, поскольку полученные значения 50%-й протективной дозы превышали 50 PD₅₀/0,5 см³, а нижний интервал был выше 35 PD₅₀/0,5 см³. Тем не менее среди испытуемых образцов более иммуногенным препаратом для контроля ньюкаслской болезни у кур, вызванной вирусами генотипа VII, оказалась вакцина «ВНИИЗЖ-АвиНью Мульти». Полученные в ходе исследования данные подтверждают результаты, описанные ранее другими авторами [31][32], указывающими на возможную неэффективность вакцинации в случае недостаточного генетического соответствия между вакцинными и полевыми штаммами вируса ньюкаслской болезни. Обозначенная проблема, в свою очередь, делает актуальной задачу по усовершенствованию мер специфической профилактики ньюкаслской болезни и обновлению вакцинных штаммов в соответствии с эпизоотической ситуацией как в мире, так и в конкретном регионе ее применения.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В результате проведенного опыта было установлено, что все исследуемые вакцины с цельным (неразведенным) содержанием антигена вызывали формирование напряженного поствакцинального иммунитета спустя 28 сут после введения курам, а также соответствовали требованиям ВОЗЖ, предъявляемым к препаратам против ньюкаслской болезни. Тем не менее вакцины на основе штаммов II и VII генотипов вируса ньюкаслской болезни «ВНИИЗЖ-АвиНью Мульти» и «ВНИИЗЖ-АвиНьюФлу Мульти» при контрольном заражении высоковирулентным изолятом вируса ньюкаслской болезни генотипа VII показали более высокий уровень протективной активности при использовании разведенного антигена.

Вклад авторов: Вершинина М. А. – формирование идеи, проведение исследований, анализ и интерпретация полученных данных, принятие ответственности за все аспекты работы, целостность всех частей статьи и за ее окончательный вариант; Мороз Н. В. – формирование идеи, формулировка и развитие ключевых целей и задач; Фролов С. В. – анализ и интерпретация полученных данных, критический пересмотр черновика рукописи с внесением ценных замечаний интеллектуального содержания.

Contribution of the authors: Vershinina M. A. – conceptualization, investigation, data analysis and interpretation, and supervision, project administration, and responsibility for final manuscript; Moroz N. V. – conceptualization, formulation and development of key aims and objectives; Frolov S. V. – data analysis and interpretation, critical revision of the manuscript draft with valuable intellectual input.