Классическая чума свиней (КЧС), вызываемая РНК-содержащим Pestivirus C, является одним из наиболее опасных вирусных заболеваний представителей семейства Suidae и сопровождается геморрагическим синдромом [1][2]. Вирус КЧС поражает преимущественно эндотелиальные клетки и макрофаги, одновременно стимулируя апоптоз Т-клеток, индуцируя выраженную иммуносупрессию; острая инфекция чаще всего завершается летальным исходом, однако в ряде случаев на фоне выработки вируснейтрализующих антител наблюдается реконвалесценция либо переход заболевания в хроническую форму [3][4]. В эндемичных по КЧС странах, как правило, применяются живые аттенуированные вакцины, однако способность вакцинных штаммов реплицироваться в организме хозяина затрудняет дифференциацию вакцинированных животных от инфицированных (стратегия DIVA), что обуславливает проведение политики ограничения вакцинации в неэндемичных странах. Таким образом, в Российской Федерации существует потребность в разработке эффективных и безопасных маркированных вакцин для контроля возможных вспышек КЧС и в перспективе для получения статуса зоны, свободной от КЧС, декларируемого Всемирной организацией здравоохранения животных [5][6].

В контексте разработок экспериментальных субъединичных вакцин имеются сведения об успешном использовании различных систем экспрессии для биосинтеза мажорного гликопротеина Е2. Ранее нами был получен прокариотический аналог гликопротеина Е2 [7], синтезируемый преимущественно в виде телец включения, что влекло за собой проведение обширных этапов хроматографической очистки и рефолдинга и, как следствие, относительно низкий выход очищенного биоактивного продукта. В качестве альтернативы коли-экспрессии может рассматриваться экспрессия генов в клетках млекопитающих, основными преимуществами которой считаются посттрансляционные модификации, близкие к нативным, а также растворимость и фолдинг рекомбинантных белков, совместимые со сверхэкспрессией [8]. Для дальнейшего масштабирования экспрессия в клетках млекопитающих должна быть недорогой и высокопроизводительной, в связи с чем возникла необходимость создания оптимизированной генетической конструкции, подбора производственной клеточной линии – потенциального продуцента рекомбинантного вакцинного антигена – и адаптации известных протоколов трансфекции к условиям данной технологической задачи.

Цель настоящей работы – оптимизация условий транзиентной трансфекции производственных линий клеток млекопитающих для экспрессии антигена Е2 вируса КЧС. Для ее достижения решались следующие задачи:

а) оценка пригодности клеточных линий CHO-K1, PK-15, BHK-21/13 для транзиентной экспрессии гена, кодирующего фрагмент гликопротеина Е2;

б) сравнение эффективности общедоступных методов невирусной доставки ДНК (кальций-фосфатной и катионной);

в) апробирование разработанных методов контроля эффективности экспрессии: иммунофлуоресценции (РИФ) на культуре клеток, количественной оценки матричных РНК (мРНК) и иммуноферментного анализа (ИФА) в антигенном варианте.

Получение рекомбинантной ДНК. Нуклеотидную последовательность, кодирующую усеченный белок Е2 вируса КЧС штамма «Ши-Мынь» (GenBank ID AF092448.2), клонировали в вектор pVAX1 (ЗАО «Евроген», Россия) по сайтам рестрикции BamHI и EcoRI. Идентичность созданной конструкции подтверждена секвенированием по Сэнгеру. Рекомбинантная плазмида была реципиирована в клетки Escherichia coli штамма DH5α (Novagen, Германия), наработана и выделена при помощи системы Midiprep (ЗАО «Евроген», Россия). Концентрацию плазмиды измеряли на спектрофотометре Nano-500 (Allsheng, Китай); чистоту образца оценивали по соотношению поглощения на длинах волн 260 и 280 нм, которое при отсутствии загрязнения полипептидами либо свободными нуклеотидами составляет 1,8–2,0 ед.

Культивирование клеток. Монослойные клетки яичника китайского хомячка (СНО-К1, ATCC® CCL 61), почки сирийского хомячка (ВНК-21/13, ATCC® CCL 10), почки свиньи (РК-15, ATCC® CCL 33) выращивали в культуральных флаконах объемом 75 см³ и чашках диаметром 100 мм (Biologix Group Ltd., Китай) в среде DMEM-F12 (НПП «ПанЭко», Россия) с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (HyClone, Австралия), 100 МЕ/мл пенициллина и стрептомицина (НПП «ПанЭко», Россия), 20 мМ L-глутамина (Sigma-Aldrich, США) при 37 °C в атмосфере 5%‑го CO2 с исходной концентрацией 10 × 10⁶ кл/мл. В ходе контроля контаминации бактерии, микоплазмы и возбудитель вирусной диареи крупного рогатого скота не обнаруживались.

Проведение трансфекции. Условия кальций-фосфатной (КФТ) и катионной (PEI) трансфекций производственных клеточных линий приведены в таблице.

Жизнеспособность клеток определяли через 24 ч после трансфекции в 96-луночных культуральных планшетах (Corning Incorporated, США) при помощи колориметрического метилтетразолиевого (МТТ) теста. В каждую лунку на 100 мкл свежей питательной среды добавляли по 10 мкл МТТ-реактива (Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd., Китай) и инкубировали в течение 3,5 ч в стандартных условиях. Образовавшиеся кристаллы формазана растворяли в эквивалентном объеме диметилсульфоксида, после чего измеряли поглощение в каждой лунке при длине волны 570 нм. Долю жизнеспособных клеток рассчитывали по соотношению показателей лунок с трансфицированными и интактными клетками.

Оценка уровней экспрессии матричных РНК. Транскрипционную активность фрагмента гена Е2 оценивали путем количественного определения его продукта – специфических мРНК. Нуклеиновые кислоты из трансфицированных клеток выделяли при помощи набора реагентов «РИБО-сорб» (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия); выделенные образцы обрабатывали ДНКазой (НПК «Синтол», Россия) из расчета 1 ед. на 10 нг ДНК и инкубировали 1 ч при 37 °С с последующей инактивацией в течение 5 мин при 80 °С. Для проведения амплификации использовали реакционную смесь следующего состава (на одну пробу объемом 20 мкл): 4 мкл готовой ПЦР-смеси 5× qPCRmix-HS SYBR, 5 пМ прямого (5′-CGTCAACCAATGAGATAGGGCTGT-3′) и обратного (5′-GCACAGCCCGAATCCGAAGT-3′) праймеров, 100 ед. MMLV-ревертазы (ЗАО «Евроген», Россия), 15 нг РНК-матрицы, ddH2O – до 20 мкл. Для построения калибровочной кривой использовали 10-кратные разведения рекомбинантной плазмиды pVAX1-trE2. Полимеразную цепную реакцию с обратной транскрипцией в режиме реального времени (ОТ-ПЦР-РВ) проводили на амплификаторе С1000 с оптическим блоком CFX96 (Bio-Rad Laboratories, Inc., США) согласно следующей программе: 1 – обратная транскрипция при 37 °С в течение 5 мин; 2 – денатурация ДНК при 95 °С в течение 5 мин; 3 – 35 циклов, состоящих из 30 с при 94 °С, 30 с при 56 °С, 25 с при 72 °С; 4 – элонгация при 72 °С в течение 10 мин. Графический анализ кривых плавления ампликонов проводили в программе CFX Manager (Bio-Rad Laboratories, Inc., США); количество копий мРНК в образце представлено из расчета на 1 мкг суммарной РНК.

Реакция иммунофлуоресценции на культуре клеток. Окрашивание трансфицированных клеток проводили ФИТЦ-конъюгатом поликлональных антител свиньи к вирусу КЧС (ФГБНУ «ФЦТРБ-ВНИВИ») в рабочем разведении 1:500, как описано в предыдущей работе авторов [9].

Выделение целевого белка. Через 48–72 ч после трансфекции клетки с поверхности культуральных флаконов снимали механически при помощи скребков. Клетки из суспензии осаждали при 3000 g в течение 15 мин, осадок заливали 1 мл охлажденного RIPA-буфера (50 мМ трис-HCl, pH 7,4; 150 мМ NaCl; 1 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты; 1% тритона X-100; 0,1% дезоксихолата натрия; 0,1% SDS додецилсульфата натрия; 0,1 мМ фенилметилсульфонил фторида) и инкубировали в течение 30 мин во льду, после чего повторно осаждали клетки. Наличие белка в супернатанте подтверждали методом аналитического электрофореза в 15%-м полиакриламидном геле в денатурирующих условиях; активность по отношению к специфическим антисывороткам оценивали в ИФА с применением ранее разработанной тест-системы для контроля специфичности рекомбинантного антигена вируса КЧС [10].

Статистический анализ проводили при помощи программного обеспечения GraphPad Prism 10.4 (GraphPad Software, США).

В ходе биоинформационного анализа был идентифицирован фрагмент аминокислотной последовательности, характеризующийся наибольшей плотностью расположения B-клеточных КЧС-специфических эпитопов протяженностью 188 аминокислот (690–878 а. о.). Согласно результатам pBLAST-анализа консервативность данного участка среди представителей 1‑го и 2‑го генотипов вируса КЧС составляет от 91,19 до 98,74%. Также он не обладает гомологией в отношении аналогичного участка протеома вируса вирусной диареи КРС, что является критическим фактором в выборе последовательности диагностического антигена. Для конечной аминокислотной последовательности, фланкированной гексагистидиновым тегом, была выполнена обратная трансляция; синтезированная нуклеотидная последовательность с консенсусной последовательностью Козак перед старт-кодоном была клонирована в целевой вектор pVAX1. Схема конструкции представлена на рисунке 1.

Через 24 ч после проведения трансфекции клеточных линий СНО-K1, PK-15 и BHK-21/13 была оценена их жизнеспособность (рис. 2).

Диаграмма показывает, что доля жизнеспособных клеток при применении обоих методов трансфекции с соблюдением указанных периодов инкубации с трансфицирующими агентами составляет не менее 87%. При этом при катионной трансфекции в течение 6–12 ч, а также при КФТ с продолжительностью первичной инкубации не более 6 ч выживаемость клеток превышает 93,6%. Более низкие показатели жизнеспособности (87,2–92,8%) регистрировались при КФТ с условием первичной инкубации до 12 ч. Вероятно, это связано с тем, что преципитаты кальция при продолжительной инкубации оказывают цитотоксический эффект.

На следующем этапе исследования решалась задача сравнительной оценки различных методов контроля эффективности трансфекции, а именно прямой РИФ на трансфицированных клетках, количественного анализа мРНК в ОТ-ПЦР-РВ и антигенного ИФА.

Согласно данным РИФ на культуре клеток, через 48 ч эффективность трансфекции варьировала от 60 до 90%. Наибольший показатель регистрировался при анализе монослоев линии СНО-K1: 87% для КФТ и 90% для PEI. Несколько ниже оценивалась доля флуоресцирующих клеток линии PK-15: 82% для КФТ и 85% для PEI. Наименьшая эффективность наблюдалась при трансфекции линии BHK-21/13: 80 и 65% соответственно (рис. 3).

Помимо РИФ, являющейся базовым методом оценки эффективности трансфекции, был проведен анализ экспрессии мРНК. Считается, что измерения, проводимые по уровням белка и мРНК, являются взаимодополняющими и необходимы для комплексной оценки экспрессии генов. Протокол ОТ-ПЦР-РВ предварительно апробировали на 10-кратных разведениях контрольной плазмиды pVAX1-trE2 (исходная концентрация 50 нг/мкл). Было установлено, что показатель линейности реакции (R²) составил 0,994, наклон линии (пороговое значение Ct между двумя разведениями ДНК) – минус 3,748, теоретический предел обнаружения реакции (y-int) – 29,288, эффективность реакции (Е) – 94,8%. Результаты оценки уровней специфических мРНК, рассчитанных при помощи ОТ-ПЦР-РВ, представлены на рисунке 4.

Известно, что в клетке соотношение белка и мРНК определяется процессами трансляции и деградации белка – процессами, которые регулируются на геноспецифическом уровне [11]. Общая корреляция между концентрациями мРНК и белка у многоклеточных эукариот считается значимой, но умеренной по сравнению с бактериями и дрожжами: количество молекул белка на транскрипт может сильно варьироваться [12][13]. Поэтому более объективной оценкой функциональности экспрессионной системы, особенно в условиях производства, будет являться количественный выход белка в совокупности с определением его специфичности доступным серологическим методом (рис. 5).

Согласно расчетным данным белок rE2 с прогнозируемой молекулярной массой 17,3 кДа является стабильным и растворимым. Указанные показатели не отличались среди вариантов белка, экспрессируемых всеми тремя продуцентами, что может свидетельствовать о схожести паттернов посттрансляционных модификаций. Это подтверждается сопоставимой активностью всех вариантов белка в ИФА: коэффициент позитивности варьировал в диапазоне 5,1–6,2. Наибольший выход рекомбинантного белка обеспечивала линия СНО-K1 (35,6–47,4 мг/л), наименьший – BHK-21/13 (19,3–24,1 мг/л), что согласуется с утверждением о влиянии происхождения клеток на эффективность трансфекции в схожих условиях [14]. Несмотря на то что большую эффективность трансфекции по уровням транскриптов обеспечивал катионный метод, КФТ позволяла достичь в среднем на (8,7 ± 1,4)% большего выхода функционального продукта.

В литературе описан опыт наработки рекомбинантного гликопротеина Е2 вируса КЧС в клетках млекопитающих. Так, в работе R.-H. Hua et al. [15] сообщается о получении стабильно экспрессирующей линии BHK-21 при помощи вектора pCAG с продуктивностью до 45 мг/л; рекомбинантный белок обеспечивал 100%-ю защиту свиней при летальном заражении. Tian H. et al. [16] удалось создать усеченный белок Е2, содержавший КЧС-специфические домены и вызывавший сероконверсию у кроликов, в клетках PK-15, трансфицированных ретровирусным вектором pBABE puro. Использование клеточной линии СНО также обеспечивало значительный вход рекомбинантного Е2: L. Feng et al. [17] получены стабильные трансгенные клетки rCHO с динамическим промотором Txnip, что легло в основу стратегии индуцируемой экспрессии. Таким образом, экспрессия в клетках млекопитающих является эффективным инструментом масштабного биосинтеза сложных гликопротеинов, применимым в разработке кандидатных субъединичных вакцин [18][19][20].

В настоящем исследовании рассмотрено применение стандартных методов трансфекции в отношении нескольких производственных клеточных линий млекопитающих для получения рекомбинантного антигена Е2 вируса КЧС, а также методы контроля эффективности экспрессии. Было установлено, что клеточные линии CHO-K1, PK-15, BHK-21/13 успешно подвергаются трансфекции в стандартных условиях с эффективностью до 90%, при этом наибольшая трансфицируемость, как и наибольший тотальный выход целевого белка, были характерны для линии CHO-K1. Ввиду того, что всем рассматриваемым клеточным линиям присущи высокая скорость пролиферации, простота культивирования, в том числе суспензионного, адаптация к бессывороточным средам, они имеют высокий потенциал использования для получения клональных линий-продуцентов в зависимости от конкретных технологических задач. Также установлено, что оба рассматриваемых метода – КФТ и PEI – обеспечивали достаточно высокую эффективность трансфекции и сопоставимые уровни выхода целевого белка; их достоинствами являются экономичность и воспроизводимость.

Сравнительная оценка методов контроля эффективности трансфекции – РИФ, количественной ПЦР и непрямого ИФА – показала, что на этапе конструирования экспрессионных систем их целесообразно применять комплексно. Проведение РИФ с использованием ФИТЦ-меченых поликлональных антител хотя и является информативной на начальных этапах синтеза белка, требует постоянного контроля контаминации клеточных линий и фетальных сывороток крови крупного рогатого скота вирусом вирусной диареи, которая приводит к ложноположительным результатам. Количественная детекция мРНК не всегда коррелирует с выходом целевого продукта, поэтому применение этого метода оправданно лишь при необходимости первичной оценки транскрипционной активности гена. В условиях производства наиболее точным ориентиром является тотальный выход целевого белка, что удобно контролировать в количественном или полуколичественном варианте ИФА, особенно при работе со стабильно экспрессирующими клеточными линиями.

Несмотря на то что в данной работе для тестовой экспрессии использовали нуклеотидную последовательность, кодирующую усеченный антиген диагностического назначения – фрагмент гликопротеина Е2 с наибольшей плотностью расположения КЧС-специфических доменов, описанные подходы при условии грамотного дизайна конструкции, кодирующей полноразмерный гликопротеин, актуальны для разработки рекомбинантной субъединичной вакцины против КЧС.

Вклад авторов: Галеева А. Г. – концепция исследования, работа с литературой, проведение экспериментов, подготовка текста; Кузнецова Ю. А. – проведение экспериментов, сбор материала; Ахунова А. Р. – проведение экспериментов, подготовка текста; Хаммадов Н. И. – биоинформатический анализ, работа с литературой; Хаертынов К. С. – проведение экспериментов, интерпретация данных; Мухаммадиев Рин. С. – проведение экспериментов, интерпретация данных; Ефимова М. А. – администрирование, анализ и обобщение результатов исследования.

Contribution of the authors: Galeeva A. G. – development of the study design, literature analysis, conducting experiments, preparation of the paper text; Kuznetsova Yu. A. – conducting experiments, data collection; Akhunova A. R. – conducting experiments, preparation of the paper text; Khammadov N. I. – bioinformatics analysis, literature analysis; Khaertynov K. S. – conducting experiments, data interpretation; Mukhammadiev Rin. S. – conducting experiments, data interpretation; Efimova M. A. – administering, study result analysis and generalization.