Воспаление ткани молочной железы (мастит) является одним из наиболее экономически затратных заболеваний крупного рогатого скота. Активно ведется оптимизация профилактических мер и схем лечения, в том числе с целью экономии труда и финансовых средств. К таким мероприятиям можно отнести профилактику вакцинацией и применение различных антимикробных препаратов [1-3]. Альтернативой, ведущей к уменьшению количества случаев маститов в хозяйствах, является геномная селекция. Длительная селекция молочного скота, направленная исключительно на увеличение продуктивности, пригодности молочной железы к машинному доению, привела к развитию повышенной восприимчивости к маститу в результате ослабления сфинктера соскового канала – естественного защитного барьера для проникновения инфекционных патогенных агентов [4]. Восприимчивость к маститу зависит от ряда факторов – как внешних (кормление, содержание, воздействие стресса, организация процессов доения), так и внутренних (иммунные процессы в организме, механизм которых важно понимать, чтобы повысить резистентность животных) [5].

Иммунный ответ играет ключевую роль в патогенезе заболеваний. Толл-подобный рецептор 4 (TLR4) – внутренний иммунный рецептор – демонстрирует широко распространенную экспрессию in vivo, нарушение его работы способствует возникновению различных болезней, включая сердечно-сосудистые заболевания, неопластические состояния и воспалительные процессы в организме [6]. В результате поиска ассоциаций с риском развития колиэнтерита было обнаружено, что аллель G* полиморфизма rs8193046 гена TRL4 более распространена среди телят, страдающих диареей, по сравнению с контрольной группой животных [7]. В исследовании ассоциации однонуклеотидного полиморфизма (SNP) с риском развития паратуберкулеза, вызванного Mycobacterium avium, показано, что гетерозиготы A/G имели больший риск развития данного инфекционного заболевания [8]. В эксперименте по поиску гаплотипов полиморфизмов в гене TLR4, проведенном в разных популяциях крупного рогатого скота, было выявлено, что аллель A* присутствует во всех гаплотипах, имеющих отрицательный вклад в значения индекса соматических клеток в молоке, аллель C* также имеет негативный эффект, а G* – положительный [9]. Стоит отметить, что в данной работе не сделаны поправки на множественное сравнение при поиске статистически значимых гаплотипов. При этом в исследовании ассоциации отдельных SNPs с риском развития субклинического мастита показано, что особи с генотипом G/G имеют бóльшие средние значения индекса соматических клеток в молоке [10].

Для полиморфизма rs8193060 продемонстрированы достоверные ассоциации с репродуктивными признаками: частота встречаемости кистозных яичников, ранние репродуктивные нарушения, легкость отела и продуктивное долголетие [11]. Существуют данные о связи полиморфизма с риском развития паратуберкулеза, причем установлено, что генотип C/T является неблагоприятным вариантом [12]. В исследовании по поиску гаплотипов полиморфизмов в гене TLR4 для rs8193060 получены неоднозначные результаты: аллель C* присутствует в гаплотипах как с положительным, так и с отрицательным эффектом [9]. При анализе ассоциаций rs8193060 с индексом соматических клеток показано, что генотип T/T является неблагоприятным [10].

Наибольшей плейотропией по результатам полногеномных исследований обладает полиморфизм rs29017188. Имеются данные о его влиянии на межотельный период [13], постоянство лактации [14] и состав молока [15].

К сожалению, на сегодняшний день не выявлено, как именно полиморфизмы гена TLR4 воздействуют на иммунные функции организма. В работе R. R. Bhat et al. описан предположительный механизм влияния полиморфизмов в 5’-нетранслируемом регионе и промоторах гена TLR4. Исследователями обнаружен низкий уровень гетерозиготности в данных локусах у особей с предрасположенностью к развитию мастита, что, вероятнее всего, обусловлено связыванием данных участков с транскрипционными факторами, это в конечном счете снижает уровень экспрессии данного гена [16].

Исходя из вышеизложенного, целью исследований являлось изучение генетического разнообразия и поиск ассоциаций полиморфизмов гена TRL4 с риском развития мастита крупного рогатого скота.

Для проведения генотипирования крупного рогатого скота в количестве 421 гол. использован протокол, ранее описанный A. Q. de Mesquita et al. [10], с изменением олигонуклеотидов для rs8193046 (табл. 1). При этом по rs8193060 и rs29017188 генотипированы все животные, а по rs8193046 – 387 особей. Исследованы коровы из пяти сельскохозяйственных организаций Уральского региона.

Критерием отнесения животного к группе риска являлось наличие случаев клинического и субклинического мастита в анамнезе. Для диагностики субклинического мастита использовали экспресс-тесты по определению содержания соматических клеток в молоке. Если у животного не были зарегистрированы случаи мастита в течение трех лактаций, а также экспресс-тест показал отрицательный результат, то оно считалось устойчивым к маститу. У всех животных проводился отбор крови из хвостовой вены в вакуумные пробирки с ЭДТА (этилендиаминтетрауксусной кислотой) в качестве фиксатора.

Распределение генотипов проверяли на соответствие закону Харди – Вайнберга, вычисления степени неравновесного сцепления и индекса разнообразия Шеннона выполнены с помощью пакета GenAlEx (версия 6.5) для Microsoft Excel [17]. Графики для отражения степени неравновесного сцепления построены с использованием веб-инструмента SRplot [18].

Ассоциативные тесты для каждого SNP в отдельности, поиск наиболее распространенных гаплотипов и их ассоциаций с риском развития мастита выполнены в программной среде R с помощью пакета SNPassoc (версия 2.1.0) [19].

Аллельное разнообразие и распределение генотипов представлено в таблице 2. При расчете критерия Харди – Вайнберга число степеней свободы было принято за 1. По результатам проведенного анализа в случае полиморфизма rs8193046 выявлено статистически значимое отклонение от равновесного распределения аллелей. Подобные отклонения могут возникать по ряду причин: давление отбора, ошибки генотипирования, инбредные скрещивания. Наиболее вероятным объяснением является давление искусственного отбора.

По данным анализа неравновесного сцепления можно сделать вывод, что пары аллелей rs8193046 и rs8193060, а также rs29017188 и rs8193060 наследуются несцепленно: R2 = 0,2 и R2 = 0,4 соответственно (рис. 1).

Также проведена оценка генетического разнообразия исследуемых популяций крупного рогатого скота по полиморфизмам гена TLR4. Индекс биологического разнообразия Шеннона, приближаясь к единице, отражает высокий уровень разнообразия. В результате анализа установлено, что разнообразие между популяциями выражено слабо (D’ = 0,015). Однако в среднем внутри популяций можно наблюдать более высокое значение индекса разнообразия (D’ = 0,403), из чего можно сделать вывод об их генетической стабильности (рис. 2). Поскольку различия в разнообразии по данным полиморфизмам между анализируемыми популяциями не наблюдается, дальнейшие исследования проведены совместно.

По отдельности для каждого из исследуемых полиморфизмов гена TLR4 проведены ассоциативные тесты, направленные на выявление связи с риском развития мастита, краткое содержание результатов которых представлено в таблице 3. SNP rs29017188 показал наибольшее количество статистически значимых моделей наследования, в том числе и с учетом поправки Бонферрони, тогда как рецессивная модель наследования риска мастита была значимой для rs8193046 и rs29017188. Рецессивная модель наследования для rs8193046 также имеет наименьшее значение информационного критерия Акаике (AIC), а отношение шансов (odds ratio, OR) указывает, что у животных с генотипом A/A выше риск развития мастита. Для rs29017188 рецессивная модель также имела наименьшее значение AIC, OR для генотипа C/C было равно 2,30, то есть у особей исследованных популяций риск заболеваемости маститом предположительно выше более чем в 2 раза.

Результаты поиска гаплотипов показали, что ACC, GCG, GTG (для аллелей SNP rs8193046, rs8193060, rs29017188 соответственно) являются самыми распространенными – на их долю приходится более 85% всей выборки (табл. 4).

Животные с гаплотипом GCG имеют статистически значимый более низкий риск развития мастита (для SNP rs8193046, rs8193060, rs29017188). Предполагаем, что увеличение доли особей с данным гаплотипом в хозяйствах, где остро стоит проблема заболеваемости маститом коров молочного направления продуктивности, может оказать положительный эффект на распространение данного заболевания. Результаты поиска ассоциаций гаплотипов с фенотипами совпадают с результатами по выявлению ассоциаций отдельных полиморфизмов и в большей степени согласуются с данными, полученными X. P. Wang et al. [9].

В ходе работы был проведен анализ генетического разнообразия уральских популяций крупного рогатого скота молочного направления продуктивности. Для полиморфизма rs8193046 гена TRL4 обнаружено отклонение от равновесия Харди – Вайнберга, что, вероятнее всего, связано с воздействием давления искусственного отбора.

На основании результатов ассоциативных тестов сделано предположение, что SNP rs8193046 и rs29017188 являются наиболее перспективными кандидатами для использования в селекционных программах для снижения риска заболеваемости маститом в исследованных популяциях. Стоит отметить низкую эффективность экстраполяции геномных оценок даже среди популяций одной породы, однако полученные в ходе исследования результаты совпадают с ранее представленными данными [9]. Установлено, что гаплотип GCG для rs8193046, rs8193060, rs29017188 является статистически значимым по результатам поиска ассоциаций. По данному гаплотипу, вероятно, можно проводить положительный отбор для снижения риска развития клинического мастита в популяциях крупного рогатого скота молочного направления продуктивности.