Новый коронавирус (SARS-CoV-2) стал причиной пандемии острой респираторной инфекции, которая охватила весь мир и привела к гибели нескольких миллионов человек [1]. Заболевание у инфицированного человека может проходить как бессимптомно, так и в форме тяжелой пневмонии, приводящей к смерти в случае тотального поражения легких. SARS-CoV-2 – оболочечный одноцепочечный РНК-содержащий вирус семейства Coronaviridae, рода Betacoronavirus. Вирион вируса имеет характерный вид короны с шиповидными (S), мембранными (M) и оболочечными (E) белками, расположенными в двухслойной фосфолипидной оболочке. РНК-геном размером 30 kb кодирует 16 неструктурных белков и 4 основных структурных белка: спайк (S), мембранный (M), оболочечный (E) и нуклеокапсидный (N) [2].

Помимо людей, SARS-CoV-2 способен заражать многие виды млекопитающих [2-10]. По данным Всемирной организации здравоохранения животных (ВОЗЖ), новый коронавирус выявляли у кошек, собак, грызунов (хомяков), норок и хорьков, зоопарковых животных (обезьян, тигров, львов, пум и др.), оленей, лис, лошадей. С начала пандемии 35 стран заявили в ВОЗЖ о выявлении SARS-CoV-2 у животных, что следует из обзора информационно-аналитического центра Россельхознадзора [11].

В настоящее время установлено, что вирус может передаваться от одного вида животного к другому, от человека к животному и от животного к человеку [12-18].

В мае 2023 г. Всемирная организация здравоохранения объявила о конце пандемии, однако некоторые группы ученых считают данное объявление преждевременным. Они предполагают, что вирус может представлять угрозу общественному здравоохранению в течение десятилетий. Даже при условии полной ликвидации циркуляции вируса в популяции людей SARS-CoV-2 будет представлять опасность для здоровья человека, домашних и диких животных из-за скрытых резервуаров в дикой природе [13][19][20].

Потенциально некоторые виды животных могут играть роль природного резервуара этого вируса. С целью изучения такой возможности в некоторых странах проводится серологический мониторинг новой коронавирусной инфекции в популяциях домашних и диких животных. Так, во Франции на наличие антител к SARS-CoV-2 было исследовано более 5600 проб сывороток крови, полученной от кошек и собак, а в Китае – более 20 000 проб от этих двух видов животных. В США активно проводится серомониторинг новой коронавирусной инфекции в дикой фауне. Высокая серопревалентность обнаружена у енотов, белок, рыжих лисиц, опоссумов, скунсов, белоногих мышей и белохвостых оленей [21-23].

Исследование распространения SARS-CoV-2 среди диких и домашних животных требует наличия соответствующих диагностических инструментов. В 2021 г. в ФГБУ «ВНИИЗЖ» разработана иммуноферментная тест-система для выявления антител к SARS-CoV-2 в сыворотках крови животных [24]. В разработанном методе в качестве антигена используется инактивированный коронавирус. Однако для получения такого антигена необходимо культивировать вирус, что сопряжено с высоким биологическим риском. Более безопасной альтернативой антигену, получаемому из нативного вируса, могут быть рекомбинантные белки SARS-CoV-2, производимые в про- или эукариотических системах экспрессии. Ранее было показано, что наиболее иммуногенным белком SARS-CoV-2 с консервативным аминокислотным составом является нуклеокапсидный протеин [25][26].

Цель данной работы заключалась в получении рекомбинантного нуклеокапсидного белка SARS-CoV-2, который в дальнейшем может быть использован в качестве антигена в иммуноферментном анализе.

Вирус. Для выделения РНК SARS-CoV-2 был использован клинический материал (назальные смывы) от человека с подтвержденным диагнозом на COVID-19.

Вирусную РНК выделяли на стекловолокнистых фильтрах GF/F по методике О. Г. Грибанова и соавт. [27].

Обратная транскрипция и полимеразная цепная реакция (ОТ-ПЦР). N-ген SARS-CoV-2 амплифицировали методом ОТ-ПЦР. Продукты реакции анализировали с помощью электрофореза в 1,5%-м агарозном геле, содержащем 0,001% бромистого этидия, при силе тока 50 мА.

Молекулярное клонирование продукта ОТ-ПЦР осуществляли по общепринятым методикам [28]. В работе использовали плазмиду pQE (QIAGEN, Нидерланды), штамм Escherichia coli JM109 (Promega, США).

Синтез рекомбинантного белка. Культивирование Е. coli проводили в орбитальном шейкере при 150 об/мин и 37 °С. В дневную культуру клеток, достигшую логарифмической фазы роста, добавляли индуктор ИПТГ (изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозид). Уровень синтеза и размер рекомбинантных белков определяли с помощью электрофореза в 12%-м полиакриламидном геле.

Очистка рекомбинантного белка проводилась методом металл-хелатной хроматографии с применением Ni-NTA-агарозы (Thermo Fisher Scientific, США).

Непрямой вариант иммуноферментного анализа (ИФА) осуществляли с использованием ТБС-Т (трис-буферный раствор с добавлением Tвин-20) для промывки планшетов. Для блокировки участков неспецифического связывания и для разведения сывороток и антивидового конъюгата применяли 1%-е молоко на основе ТБС-Т. В работе использовали конъюгат протеина А фирмы КPL (Италия). В качестве субстрата для пероксидазного конъюгата применяли АБТС (2,2-азино-бис (3-этилбензтиозолин-6-сульфоновая кислота).

Для молекулярного клонирования N-ген SARS-CoV-2 получили методом ОТ-ПЦР. При амплификации использовали праймеры, содержащие в своей последовательности сайты рестрикции BamHI и SalI.

После рестрикции соответствующими ферментами ампликон применяли для лигирования в плазмидный вектор, который был получен после обработки плазмиды pQE соответствующими рестриктазами. Лигазную смесь, содержащую обработанный ампликон и плазмидный вектор, вносили в компетентные клетки штамма JM109 E. сoli методом химической трансформации. Клетки E. coli высевали на LB-агар, содержащий 100 мкг/мл ампициллина. В результате трансформации был проведен скрининг полученных колоний и отобрано несколько клонов E. coli, синтезирующих рекомбинантный нуклеокапсидный белок SARS-CoV-2, содержащий на N-конце полигистидиновый остаток. Молекулярная масса белка составила 33 кДа, что соответствовало расчетным данным.

Для увеличения концентрации синтезируемого рекомбинантного белка в отобранном клоне E. coli были определены оптимальная концентрация индуктора, оптимальный период экспрессии, обеспечивающие максимальное накопление белка в бактериальных клетках.

Для установления оптимальной концентрации индуктора использовали растворы 0,1; 0,2; 0,5 и 1,0 мМ ИПТГ. Уровень экспрессии белка определяли по электрофореграмме визуально. Накопление рекомбинантного белка достигало пика при концентрации ИПТГ 0,5 мМ и не изменялось при двукратном увеличении концентрации индуктора. Концентрацию 0,5 мМ установили как оптимальную, и в дальнейшем все работы по экспрессии проводили при данной концентрации индуктора.

Для определения оптимального периода экспрессии рекомбинантного белка исследовали лизат клеток E. coli через 2, 4 и 18 ч после индукции. Анализ уровня накопления белка проводили в 12%-м полиакриламидном геле. Максимальный уровень экспрессии рекомбинантного белка наблюдали через 4 ч после внесения индуктора (рис. 1). Через 18 ч количество белка было ниже, что, возможно, связано с его разрушением при длительном культивировании E. coli. Таким образом, 4 ч после индукции были приняты в качестве оптимального времени для синтеза рекомбинантного белка.

Очистку рекомбинантного белка проводили методом металл-хелатной хроматографии. При приготовлении лизата клеток в нативных условиях большая часть белка оставалась в клеточном дебрисе, поэтому в дальнейшем лизис проводили в денатурирующих условиях.

Для получения очищенного препарата белка в максимальной концентрации были проведены работы по поиску оптимального состава лизирующего и элюирующего буферов.

В составе лизирующего буфера № 1 использовали 8 М мочевину, лизирующего буфера № 2 – 6 М гуанидингидрохлорид (Gu-HCl). В денатурирующих условиях большая часть белка уходила из клеточного дебриса в надосадок. Выход белка был примерно одинаковым как с применением 8 М мочевины, так и с применением 6 М Gu-HCl (рис. 2). В качестве денатурирующего агента было принято использовать 8 М мочевину.

Очистку клеточного лизата проводили методом металл-хелатной хроматографии с применением агарозы Ni-NTA (никель-нитрилоацетат). Для элюирования N-белка были использованы 4 варианта буферов: буфер A (8 М мочевина, 0,1 М Na2HPO4, 0,01 М трис-Cl, рН 4,0), буфер B (8 М мочевина, 0,1 М Na2HPO4, 0,01 М трис-Cl, 0,2 М имидазол, рН 8,0), буфер C (8 М мочевина, 0,1 М Na2HPO4, 0,01 М трис-Cl, 0,4 М имидазол, рН 8,0), буфер D (8 М мочевина, 0,1 М Na2HPO4, 0,01 М трис-Cl, 0,5 М имидазол, рН 8,0). Концентрацию белка в каждом элюате оценивали визуально по электрофореграмме. Наибольшая концентрация рекомбинантного белка была в элюате с использованием буфера C (рис. 3). Таким образом, максимального выхода очищенного N-белка удалось добиться при денатурации буфером с 8 М мочевиной и элюации буфером, содержащим 0,4 М имидазола.

При проведении экспериментов по оптимизации условий экспрессии и очистки была установлена следующая схема получения рекомбинантного нуклеокапсидного белка SARS-CoV-2. В 0,1 л среды LB с 100 мкг/мл ампициллина вносили 1 мл клеточной суспензии рекомбинантного клона E. coli, полученной после ночной инкубации, и инкубировали при 150 об/мин и 37 °С до достижения плотности OD600 = 0,5. Индукцию проводили внесением ИПТГ до конечной концентрации 0,5 мМ и инкубировали еще 4 ч при 150 об/мин и 37 °С. Клеточную суспензию осаждали в течение 15 мин при 5000 об/мин. Осадок ресуспендировали в 5 мл лизирующего буфера с 8 М мочевиной. Клеточный дебрис удаляли центрифугированием в течение 5 мин при 12 000 об/мин. Надосадок использовали для проведения металл-хелатной хроматографии. Осветленный лизат перемешивали с 1 мл сорбента (агароза Ni-NTA) в течение 15 мин, после чего полученную суспензию центрифугировали в течение 1 мин при 12 000 об/мин. Осадок промывали два раза лизирующим буфером. Элюирование производили добавлением к осадку 1 мл элюирующего буфера с 0,4 М имидазолом, перемешивали в течение 1 мин, после чего центрифугировали в течение 1 мин при 12 000 об/мин. Надосадок исследовали на наличие рекомбинантного белка. Для оценки степени очистки и размера полученного белка проводили электрофорез в 12%-м полиакриламидном геле (рис. 4). Концентрацию белка определяли по Бредфорду.

В результате оптимизации параметров экспрессии и очистки рекомбинантного нуклеокапсидного белка SARS-CoV-2 получили препарат белка в высокой концентрации. Выход очищенного протеина с 100 мл культуры E. coli составил 1,5 мг.

Антигенную активность рекомбинантного нуклеокапсидного белка SARS-CoV-2 проверяли в непрямом варианте твердофазного ИФА с контрольными сыворотками крови кроликов. Для этого рекомбинантный белок, разведенный 1:800 в карбонатно-бикарбонатном буфере, вносили в лунки иммунологического планшета и инкубировали в течение ночи. После блокировки неспецифических участков связывания и последующей отмывки в лунки планшета вносили контрольные сыворотки крови кролика в разведении от 1:20 до 1:2560. В качестве положительного контроля использовали сыворотку крови от трех кроликов, иммунизированных антигеном SARS-CoV-2 (+К), в качестве отрицательного контроля – сыворотку крови от неиммунизированного кролика (–К). Через 1 ч сыворотки удаляли, планшет промывали и добавляли пероксидазный конъюгат протеина А. Еще через 1 ч планшеты промывали и затем проявляли реакцию добавлением субстрата АБТС. Результаты ИФА отражены в таблице.

Показано, что рекомбинантный нуклеокапсидный белок продемонстрировал высокую антигенную активность с положительными контрольными сыворотками и отсутствие неспецифического связывания с отрицательной контрольной сывороткой.

Проведено молекулярное клонирование гена, кодирующего нуклеокапсидный белок SARS-CoV-2, с использованием прокариотической системы экспрессии.

Получены клоны E. coli, экспрессирующие рекомбинантный нуклеокапсидный белок.

Были установлены условия экспрессии и очистки, обеспечивающие высокий выход очищенного антигена.

В непрямом варианте ИФА показано, что полученный рекомбинантный белок имеет высокую антигенную активность и позволяет выявлять антитела к SARS-CoV-2 в сыворотках крови животных.