В настоящее время высокопатогенный грипп птиц (ВПГП) – это актуальная проблема для птицеводства всего мира. Вирус ВПГП (H5N1) является причиной разрушительных эпизоотий, приносящих значительный экономический урон. Например, в 2022 г. в результате распространения ВПГП (H5N1) во Франции к марту было уничтожено 11 млн птиц, в США к сентябрю 2022 г. потери превысили 20 млн гол. [1][2]. Всего в 2022 г. 67 стран на пяти континентах сообщили о вспышках ВПГП (H5N1), что привело к потере более 131 млн гол. домашней птицы [3]. В период с апреля по июнь 2023 г. вспышки ВПГП (H5N1) были зарегистрированы в 25 странах Европы среди домашних и диких птиц, всего 98 и 634 эпизода соответственно [4].

В Российской Федерации, по данным Россельхознадзора, на 17.10.2023 вспышки ВПГП (H5N1) зарегистрированы: в 57 населенных пунктах – среди дикой птицы; в 6 – на птицефабриках; в 8 – среди домашней птицы в личных подсобных хозяйствах [5]. Отмечено, что в этом году болезнь поражала нетипичные виды диких птиц, а именно чаек. Например, очагом заболевания в Москве стали Борисовские пруды, где были найдены погибшие чайки, из останков которых был выделен геном вируса ВПГП подтипа H5N1 [6]. В центральных регионах России неблагополучные по гриппу птицефабрики во всех случаях находятся в непосредственной близости от населенных пунктов, где зафиксированы вспышки ВПГП (H5N1) среди диких птиц [5], что явно указывает на источник распространения вируса.

Широкое распространение гриппа в первую очередь связано с особенностями возбудителя. На этапе синтеза в инфицированной клетке вирусная РНК не имеет механизма репарации и сохраняет все возможные «ошибки» структуры, которые с вероятностью не менее чем 1/106 детерминируют изменения фенотипа вируса [7]. В сравнении с ДНК-содержащими вирусами, у которых вероятность ошибки при репликации генома составляет не более 1/109, это разница в три порядка. Каждый раунд репликации РНК-вируса приводит к образованию смешанной популяции со множеством вариантов, большинство из которых нежизнеспособны, но некоторые из них содержат мутации, которые могут стать доминирующими при соответствующих условиях отбора [8, 9]. На уровне фенотипа это могут быть изменения антигенных свойств и/или изменения тропизма возбудителя. В первом случае измененный агент может уклониться от иммунного ответа макроорганизма, во втором – может повысить вирулентность.

Подчеркнем, что геном вируса гриппа представлен независимыми фрагментами РНК (8 фрагментов). В случае инфицирования одной клетки различными вариантами вируса может произойти рекомбинация – обмен фрагментами генома, что приведет к качественным изменениям свойств возбудителя, вплоть до изменений видового спектра патогенности [1]. Например, в июне 2023 г. в Польше у 24 домашних кошек был выявлен вирус гриппа A (H5N1). У инфицированных животных наблюдались неврологические и респираторные признаки, в некоторых случаях наступала гибель. В июле 2023 г. в Великобритании было зарегистрировано два случая обнаружения у людей вируса гриппа A подтипа H5N1 и в двух случаях был выделен вирус гриппа A подтипа H9N2 [4].

Таким образом, представленный на рисунке 1 фрагмент схемы известных экологических ниш вируса гриппа [10] лишь частично отражает сферу обитания возбудителя в природе.

Наряду с ограничительными мерами надежным способом борьбы с ВПГП служит специфическая профилактика. Среди антигриппозных вакцин наиболее широкое распространение имеют инактивированные цельновирионные препараты [11][12]. Протективный эффект таких вакцин зависит от двух связанных составляющих: концентрации антигена в составе препарата и структурного соответствия между антигенами вакцины и полевого агента [12][13]. При этом из соображений эпизоотической безопасности для получения антигенов рекомендуется использовать вирус низкопатогенных вариантов [14]. Примером инактивированного препарата для специфической профилактики ВПГП на основе низкопатогенного варианта вируса является вакцина «ВНИИЗЖ-АвиФлуВак».

Целью настоящей работы была оценка эффективности инактивированной вакцины «ВНИИЗЖ-АвиФлуВак» против высокопатогенного гриппа птиц H5N1, обусловившего локальные вспышки заболевания в ряде регионов России в 2023 г.

В рамках указанной цели были поставлены следующие задачи:

– определение филогенетической принадлежности изолята вируса ВПГП, выделенного во время вспышки заболевания на территории РФ, который будет использован для испытания протективного эффекта вакцины;

– оценка 50%-й протективной дозы, содержащейся в прививном объеме вакцины;

– определение величины титра поствакцинальных антител, обеспечивающих защиту 90% вакцинированных птиц.

Объект исследования: вакцина против гриппа птиц (H5) инактивированная эмульсионная «ВНИИЗЖ-АвиФлуВак». Концентрацию антигена (D), представленного производственным штаммом «Ямал» вируса низкопатогенного гриппа птиц Н5, в прививном объеме вакцины регулировали путем разведения антигена физиологическим раствором в соотношениях 1/25, 1/50 и 1/100. При приготовлении вакцинных образцов активный компонент (антиген) объединяли с масляным адъювантом в соотношении 30:70 (по весу) и эмульгировали на высокоскоростном лабораторном смесителе «Сильверсон» (Великобритания) при скорости 6000 об/мин в течение 5 мин. Стабильность эмульсии после смешивания оценивали центрифугированием при 1000 g в течение 10 мин. Эмульсию считали стабильной, если отслоение легкой (масляной) фракции не превышало 5% по объему, а отслоения тяжелой (водной) фракции не происходило.

Таким образом, были приготовлены образцы вакцины, содержащие цельный антиген (D = 1), а также антиген в разведениях 1/25, 1/50 и 1/100 (D = 25, D = 50 и D = 100) от исходного.

Птица. В эксперименте использовали серонегативных к вирусу гриппа птиц цыплят яичного кросса Ломан Браун в возрасте 4 нед. Работу с птицей проводили в соответствии с ГОСТ 33215-2014, а также согласно требованиям Директивы 2010/63/EU (от 22.09.2010) по охране животных, используемых в научных целях.

Иммунизация птиц. Каждый образец вакцины был испытан на отдельной группе птиц численностью 10 гол. Препарат вводили внутримышечно в область груди в объеме 0,5 см3. Дополнительно была образована группа контроля активности вируса численностью 10 гол., в которой иммунизацию не проводили (интактные особи). Группы птиц содержали в изолированных боксах с автономной вентиляцией, подачей воды и корма.

Эмбрионы кур. В работе использовали развивающиеся 9–11-суточные эмбрионы кур категории СПФ (VALO BioMedia GmbH, Германия).

Выделение вируса гриппа птиц. Использовали патматериал, полученный от павших от ВПГП чаек. На фосфатном буфере (рН 7,2–7,4) готовили 10%-ю тканевую суспензию, которую центрифугировали в течение 15 мин при 1000 g. В супернатант добавляли антибиотики (100 Ед/мл бензилпенициллина натриевую соль, 100 мкг/мл стрептомицина сульфата и 50 Ед/мл нистатина). Полученный материал вводили в аллантоисную полость куриных эмбрионов в объеме 0,2 см3. Эмбрионы инкубировали при температуре 37 °С и относительной влажности 60–70%. Ежесуточно проводили овоскопию. Эмбрионы, погибшие после 24 ч инкубации и более, использовали для сбора экстраэмбриональной жидкости. Специфичность гибели подтверждали наличием гемагглютинирующей активности в реакции гемагглютинации и идентификацией в реакции торможения гемагглютинации со специфической сывороткой [15].

Определение титра вируса на эмбрионах кур. Использовали метод предельных разведений. Готовили последовательные десятикратные разведения вирусного материала на фосфатном буфере (рН 7,2–7,4). Каждое разведение тестировали на группе эмбрионов (n ≥ 5). Материал инокулировали в аллантоисную полость в объме 0,2 см3. Положительной реакцией (присутствие вируса) считали гибель эмбриона, установленную после более чем 24 ч инкубации. Расчет величины титра производили по Керберу и выражали в ЭИД50/см3.

Полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР). Суммарную РНК выделяли, используя набор RNeasy Mini Kit (QIAGEN, Нидерланды, кат. № 74106) в соответствии с инструкцией производителя. ОТ-ПЦР проводили в одну стадию с применением набора OneStep RT-PCR Kit (QIAGEN, Нидерланды, кат. № 210212) с соответствующими системами праймеров для выявления генома вируса гриппа птиц и идентификации подтипа H5N1.

Секвенирование генома вируса. Нуклеотидные последовательности фрагментов генов определяли с применением автоматического секвенатора ABI Prism 3130 (Applied Biosystems, США). Анализ и сравнение нуклеотидных и соответствующих им аминокислотных последовательностей проводили, используя пакет прикладных программ BioEdit, версия 7.0.5.3. Также для сравнительного анализа использовали ранее опубликованные в международной базе GenBank последовательности изолятов и штаммов вируса гриппа птиц А/H5 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/FLU/Database). Построение и редактирование филогенетического дерева осуществляли с помощью алгоритма NJ в реализации пакета MEGA, версия 7.

Реакция гемагглютинации (РГА). Пробы антигенсодержащих материалов исследовали в РГА в соответствии с методикой, изложенной в инструкции по применению набора для выявления антител к вирусу гриппа птиц подтипа Н5 в реакции торможения гемагглютинации. Определяли титр гемагглютинирующих единиц.

Реакция торможения гемагглютинации (РТГА). Пробы сывороток крови птиц исследовали в РТГА в соответствии с инструкцией к набору для выявления антител к вирусу гриппа птиц подтипа Н5 в реакции торможения гемагглютинации (ФГБУ «ВНИИЗЖ», Россия) [16]. Определяли величину титра антител. Положительной считали реакцию, где показатель титра имел оценку 1:16 и более, то есть 4 log2.

Заражение птиц. В группах иммунизированных и интактных птиц проводили контрольное заражение через 28 сут после вакцинации. Для этого использовали вирус ВПГП штамма A/gull/Kirov/998-1/2023 H5N1 в дозе 6,0 lg ЭИД50. Вирусный материал вводили внутримышечно в область бедра в объеме 0,5 см3. Наблюдение за клиническим состоянием зараженной птицы вели в течение 10 сут.

Обработка экспериментальных данных. Использовали общепринятые способы обработки выборок варьирующих переменных (определяли средние значения, стандартные отклонения и стандартные ошибки средних). Применяли элементы регрессионного анализа. Описание специальных статистических методов дано в тексте. Вычислительные операции и графические построения выполняли в приложении Excel.

Выделение вируса, оценка вирулентности и определение филогенетической принадлежности штамма. Установили, что исследуемый биологический материал содержал инфекционный вирус, который был летальным для эмбрионов (специфический падеж составил 23/30). При исследовании проб экстраэмбриональной жидкости в РГА получен положительный результат (от 1:64 до 1:256), по результатам ОТ-ПЦР в них установлено содержание генома вируса гриппа птиц в высокой концентрации (средняя оценка Ct = 18).

Сайт расщепления гемагглютинина выделенного вируса гриппа имел структуру -REKRRKR-, что позволило охарактеризовать его как потенциально высоковирулентный.

Внутривенная инъекция вируссодержащей экстраэмбриональной жидкости (10-кратное разведение на фосфатном буфере), произведенная в объеме 0,1 см3 10 цыплятам в возрасте 5 нед. (серонегативным к вирусу гриппа птиц), в течение последующих 10 сут привела к гибели 9 цыплят (90%), у которых наблюдали характерные для ВПГП клинические признаки (диарея, выделения из носа, цианоз неоперенных участков кожи). Специфичность падежа подтверждена в ОТ-ПЦР, с помощью которой в биологическом материале установлено присутствие генома вируса ВПГП. Полученные результаты соответствовали клиническим критериям проявления ВПГП [14].

При проведении сравнительного генетического анализа нуклеотидных последовательностей фрагмента гена гемагглютинина определили, что вирус принадлежит к азиатской генетической линии вируса ВПГП подтипа H5 (клада 2.3.4.4.b), получившего эпизоотическое распространение в предыдущие годы в странах Азии, Европы, Африки, Северной и Южной Америки. Выделенный вирус был определен как штамм вируса гриппа птиц A/gull/Kirov/998-1/2023 H5N1. Положение штамма в структуре филогенетического дерева показано на рисунке 2.

Согласно данным международных баз GenBank и GISAID (EpiFlu), наиболее генетически близкими к A/gull/Kirov/998-1/2023 H5N1 являются вирусы подтипа H5N1, выявленные в 2023 г. на территории ряда европейских стран. Исходя из сроков выявления на территории европейских стран (февраль – май 2023 г.), по данным базы GISAID (EpiFlu), идентичные изоляты активно циркулировали уже несколько месяцев, как минимум с начала 2023 г.

Таким образом, учитывая распространение вируса гриппа H5N1 в регионе, а также занос и распространение инфекции в ряде регионов Российской Федерации, в дальнейшей работе был использован штамм вируса A/gull/Kirov/998-1/2023 H5N1.

Оценка иммуногенной активности вакцин. Все образцы вакцин, содержащие определенные концентрации антигена, были испытаны на птицах параллельно. Через 28 сут после вакцинации определяли средние по группам логарифмические титры антител к вирусу гриппа птиц, установленные в РТГА (log2 Т).

Далее во всех подопытных группах птиц провели заражение штаммом A/gull/Kirov/998-1/2023 H5N1. В течение 10 сут в каждой группе ежесуточно оценивали текущие клинические показатели (c = a + b, где а и b – количество клинически больных и погибших птиц соответственно). По окончании срока наблюдений в группах определяли накопленные клинические показатели (∑c/n, где n – число птиц в группе до заражения) и вычисляли протективную активность вакцины вида Р = (1 – ∑c/n) × 100.

Показатели иммуногенной активности вакцин, установленные в подопытных группах птиц, приведены в таблице.

Исследовали связь между концентрацией антигена в прививном объеме (D) и протективной активностью (P) вакцины. Для построения наиболее вероятной модели связи показателей концентрации антигена и протективной активности вакцины применили регрессионный анализ [17]. Получили линейное регрессионное уравнение, имеющее вид Р = (–0,5184) D + 100,31  (R2 = 0,98), где Р – прогнозируемое значение индекса соответственно заданному D.

Для графического представления регрессии P и D использовали корреляционно-регрессионный анализ. Полученные результаты представлены на рисунке 3.

С помощью регрессионного уравнения рассчитали, что концентрация антигена, обеспечивающая защиту 50% (ПД50) вакцинированных птиц, равна 97, что соответствует степени разведения исходного антигена 1:97. Таким образом, протективная активность вакцины равняется 97 ПД50, что согласуется с требованиями Всемирной организации здравоохранения животных, устанавливающими ПД50 ≥ 50.

Исследование связи протективной активности вакцины и титров гуморальных антител. Провели анализ зависимости между титрами гуморальных антител (T, log2) и протективной активностью вакцины (P, %), установленными для испытанных концентраций антигена. Полученные результаты представлены на рисунке 4.

Показана линия регрессии Р по log2 T, где ‘P – индекс, прогнозируемый по уравнению ‘P = (11,093) log2 T + 26,667, имеющему оценку адекватности R2 = 0,97.

Полученное уравнение позволило определить ожидаемый титр антител (T90), который соответствует 90% защиты вакцинированных птиц. Искомая оценка составила величину log2 T90 = 5,7.

Известно, что вспышки ВПГП на птицеводческих предприятиях (например, в США) в большинстве случаев географически совпадают с путями миграции диких водоплавающих птиц [1]. Учитывая роль орнитофауны в распространении инфекции в ряде регионов РФ, штамм A/gull/Kirov/998-1/2023 H5N1 следует считать эпизоотически опасным. На этом основании использование данного штамма в качестве вируса-пробойника для оценки протективного действия вакцин против ВПГП является обоснованным.

Концентрация антигена в прививном объеме инактивированной вакцины является важнейшей характеристикой препарата. Основной антиген вируса (гемагглютинин) может быть измерен в абсолютных единицах, например в весовых [11], или в единицах действия, например в ПД50. Считается, что прививной объем эффективной вакцины против гриппа птиц должен содержать 50 ПД50 [12][14], что соответствует 0,3–7,8 [12] или 3 мкг гемагглютинина [14].

Процедура проведения острого опыта полностью соответствовала общепринятой методике [14]. Как следует из полученных результатов, прививной объем препарата «ВНИИЗЖ-АвиФлуВак» содержал 97 ПД50, это обеспечило защиту 100% иммунизированных птиц при введении одного прививного объема, что доказывает возможность практического применения вакцины в соответствии с прилагаемой инструкцией. Это означает, что антигенный потенциал «ВНИИЗЖ-АвиФлуВак» против штамма A/gull/Kirov/998-1/2023 H5N1 в 1,9 раза превосходит рекомендуемую протективную активность [14].

Ранее уже была проведена оценка протективных свойств вакцинного препарата из штамма «Ямал» [18], в результате которой показана эффективная защита против гетерологичного подтипа вируса ВПГП H5N8 на примере штамма А/duck/KChR/1590-20/2, который также принадлежит к генетической кладе 2.3.4.4b. Результаты филогенетического анализа, приведенные в данной работе, свидетельствуют об активном антигенном дрейфе вирусов гриппа птиц подтипа Н5 на территории Евразии в 2016–2023 гг. (рис. 1). Изоляты вируса гриппа птиц, против которых была экспериментально показана эффективная защита вакцинным препаратом на основе штамма «Ямал», отмечены на рисунке 2 черным треугольником.

Поскольку защита птиц от генерализованной инфекции, вызванной вирусом гриппа, в основном обеспечивается выработкой антител против вирусного гемагглютинина [19], то данные РТГА являются важными показателями напряженности поствакцинального гуморального иммунитета. Известно, что титр иммунных сывороток на уровне 4 log2 в РТГА свидетельствует о защите птиц от заболеваемости и смертности [14][19], а титр антител на уровне 6,5 log2 предотвращает в том числе локальную репродукцию вируса [20]. При этом необходимо, чтобы антитела в титре более 4 log2 присутствовали у 80% поголовья птиц [21]. При выполнении настоящих исследований защита 90% вакцинированных птиц соответствовала ожидаемым титрам 5,7 log2 для вакцины «ВНИИЗЖ-АвиФлуВак».

Результаты проведенных исследований позволили сделать следующие выводы.