Грипп птиц (ГП) – высококонтагиозная вирусная болезнь, которая может поражать несколько видов домашних птиц [1]. За последние 10 лет глобально распространились вирусы высокопатогенного гриппа птиц (ВГП) H5Nх клады 2.3.4.4 евроазиатской генетической линии Gs/Gd/96. В 2022–2023 гг. протекала беспрецедентная по масштабам панзоотия ВГП, вызванная вирусом подтипа Н5N1 евроазиатской генетической линии 2.3.4.4b [2]. Отмечено огромное количество вспышек заболевания среди домашних птиц и случаев выявления вируса у диких и синантропных птиц разных видов, а также их массовой гибели в разных странах. Вирус обнаружен у наземных и морских млекопитающих, что вызывает серьезную тревогу у мирового сообщества в связи с угрозой пандемии (WOAH Situation Reports for Avian Influenza, 2021–2023; FAO Empres-i; WHO).

Начиная с 2021 г. эпизоотии ВГП в Российской Федерации также вызваны вирусом H5N1 евразийской генетической линии (клады) 2.3.4.4b [3].

В связи с тем что заболевание наносит колоссальный ущерб птицеводству и становится энзоотичным во многих странах, в 2022–2023 гг. активно обсуждались на международном уровне вопросы о применении вакцинации как дополнительном инструменте сдерживания распространения инфекции и снижения неоправданных потерь [4-6]. Кодекс здоровья наземных животных (WOAH, глава 10.4) содержит рекомендации по вакцинации птиц против ВГП и описывает условия, при которых она может применяться [7].

В большинстве стран, где проводится вакцинопрофилактика ГП, используются в основном цельновирионные вакцины на основе низкопатогенных и генно-модифицированных низкопатогенных вирусов ГП, полученных методом обратной генетики и содержащих фрагмент гена гемагглютинина актуальных высоковирулентных вирусов подтипов Н5 и Н7.

Современные инактивированные вакцины против ГП ограниченно эффективны у гусеобразных, поэтому рекомендуется введение двойной дозы, принятой для кур, или добавление сильного стимулятора для эффективного иммунитета [8-11]. Также было показано, что двойная доза бивалентной вакцины защищала уток от болезни и гибели, но при этом антитела формировались на низком уровне (от 4 до 8 log2) и после контрольного заражения вирус выделяли от 13% вакцинированных и 100% невакцинированных особей. Неспособность вируса, используемого для заражения, вызывать повторную выработку антител у вакцинированных близкородственным штаммом Н5 птиц является убедительным доказательством отсутствия репликации вирулентного вируса среди вакцинированных уток [12]. В большинстве научных статей показано, что цельновирионные вакцины в целом эффективны для уток [9][10][13-15] и гусей [10][16], но данные виды птиц реагируют на вакцинацию по-разному [10][17].

По данным A. Kandeil et al., применение инактивированной вакцины против ГП Н5 вызывает развитие иммунного ответа у всех видов птиц, содержащихся совместно в условиях личных подсобных хозяйств (утки, гуси и куры), и титры антител достигают 10 log2 после двукратной вакцинации. Однако иммунный ответ отличался у разных видов птиц. Вакцинированные птицы после заражения оставались живы и выделяли меньше вируса по сравнению с невакцинированными. Следует отметить, что невакцинированные утки также не болели и выжили на протяжении эксперимента. Более того, вакцинированные утки выделяли больше вируса, чем вакцинированные птицы других видов [10].

Также имеется много сообщений о положительных результатах применения генно-инженерных вакцин для профилактики ВГП у домашней птицы. Так, по данным E. Niqueux et al., одновременная иммунизация двумя рекомбинантными вакцинами на основе вирусов ньюкаслской болезни и оспы птиц обеспечивала защиту мускусных уток в течение 12 недель [18]. Kim D.-H.  et al. также показали, что введение генно-инженерной вакцины на основе вируса ньюкаслской болезни эффективно защищала мускусных уток от заражения вирулентным вирусом ВГП Н5 и снижала вирусовыделение [19].

Большая часть испытаний вакцины против ГП как в лабораторных, так и в полевых условиях проводится на курах и индейках, потому что у них регистрируются высокий уровень смертности и экскреция большого количества вируса в окружающую среду при инфицировании. Однако с распространением ВГП в Азии эпизоотология заболевания изменилась, на что указывает расширение восприимчивости диких и экзотических птиц. Заражение домашних уток и гусей серьезно повлияло на поддержание и распространение ВГП подтипа Н5N1 [20].

Федеральный центр охраны здоровья животных (ФГБУ «ВНИИЗЖ») в 2022 г. зарегистрировал вакцину против ГП (Н5) «ВНИИЗЖ-АвиФлуВак» на основе низкопатогенного вируса ГП Н5 штамма «Ямал».

В рамках регистрационных действий были проведены исследования по определению прививного объема, кратности вакцинации для разных видов домашних птиц (индейки, утки и гуси) в лабораторных и производственных условиях, результаты которых представлены в данной статье.

Вакцина. В лабораторных и производственных испытаниях использовали вакцину против гриппа птиц Н5 инактивированную эмульсионную «ВНИИЗЖ-АвиФлуВак» производства ФГБУ «ВНИИЗЖ» (серия № 010122, дата выпуска 01.2022 г.). Вакцина изготовлена из экстраэмбриональной жидкости эмбрионов кур, инфицированных вирусом гриппа птиц (источник производственного штамма «Ямал» подтипа Н5N1 – вирусный изолят A/wildduck/YaNAO/956-21), инактивированной аминоэтилэтиленимином, с добавлением масляного адъюванта Montanide ISA 70 VG (SEPPIC, Франция) в весовом соотношении 30:70.

Птица. В лабораторных испытаниях использовали коммерческих птиц из благополучных по острым инфекционным болезням птиц хозяйств: 20 гол. суточных утят, 140 гол. 21-суточных утят и 40 гол. индюшат в возрасте 10 сут.

В производственных испытаниях вакцину применяли на промышленном поголовье индеек в возрасте 1 и 28 сут на одной из птицефабрик Ставропольского края и поголовье родительского стада гусей в возрасте 30 и 60 сут в Республике Башкортостан.

Схема опыта в условиях вивария. Суточных утят разделили на 2 группы по 10 гол. в каждой и вакцинировали внутримышечным методом в дозах 0,25 и 0,5 см3 соответственно. Через 28 сут после иммунизации получали сыворотку крови утят и исследовали на наличие антител к вирусу ГП Н5.

Утят в возрасте 21 сут разделили на 4 группы по 35 гол. в каждой. Птиц первой группы привили вакциной «ВНИИЗЖ-АвиФлуВак» в дозе 0,5 см3; второй – в дозе 1,0 см3; третьей – в дозе 1,5 см3. Всех утят прививали внутримышечным методом в бедро. Птиц четвертой группы не прививали. Через 7, 14 и 21 сут от утят каждой группы отбирали пробы крови для контроля сероконверсии к вирусу ГП Н5. Через 28 сут после вакцинации птиц опытных групп (по 10 гол. в каждой) заражали вирулентным вирусом гриппа А подтипа Н5 А/chicken/Stavropol/2077-6/21 Н5N1 в дозе 6,0 lg ЭИД50 внутримышечно в бедро в объеме 0,5 см3. Срок клинического наблюдения за зараженными утятами составил 10 сут.

Через 6 сут после заражения от утят отбирали ротоглоточные смывы на предмет выявления генома вируса ГП методом полимеразной цепной реакции (ПЦР).

Индеек в возрасте 10 сут разделили на четыре группы по 10 гол. в каждой. Птицу трех опытных групп вакцинировали внутримышечно в дозах 0,25; 0,5 и 1,0 см3 соответственно. Четвертую группу индеек не вакцинировали. Через 21 сут после вакцинации от птиц отбирали кровь для исследований на наличие антител к вирусу ГП подтипа Н5 в реакции торможения гемагглютинации (РТГА). Затем индеек заражали вирусом A/chicken/Stavropol/2077/6/21 H5N1 в дозе 6,0 lg ЭИД50 внутримышечно в бедро в объеме 0,5 см3. Срок клинического наблюдения за зараженной птицей составил 10 сут.

Схема опыта в производственных условиях. Экспериментальную группу индеек в количестве 700 гол. в суточном возрасте вакцинировали в дозе 0,2 см3, затем в возрасте 28 сут ее разделили на две группы по 350 гол. в каждой и повторно иммунизировали в дозах 0,5 и 1,0 см3 соответственно.

Было сформировано две группы гусей по 30 гол. в каждой. Птицу первой группы вакцинировали внутримышечным способом однократно в возрасте 30 сут в дозе 1,0 см3; второй – двукратно в возрасте 30 и 60 сут также внутримышечно в дозе 1,0 см3.

Все эксперименты на птицах проводились в строгом соответствии с межгосударственными стандартами по содержанию и уходу за животными, принятыми Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации, а также согласно требованиям Директивы 2010/63/EU Европейского парламента и Совета Европейского союза от 22.09.2010 по охране животных, используемых в научных целях.

Серологические исследования по выявлению антител к вирусу ГП Н5 проводили методом РТГА с использованием набора для выявления антител к вирусу гриппа птиц подтипа Н5 в реакции торможения гемагглютинации производства ФГБУ «ВНИИЗЖ». Результаты РТГА выражали в log2, а титр антител, равный или выше 5 log2, считали минимальным защитным титром согласно рекомендациям Всемирной организации здравоохранения животных [21].

Контрольное заражение. Устойчивость вакцинированной птицы к заражению вирусом A/chicken/Stavropol/2077/6/21 H5N1 в дозе 6,0 lg ЭИД50 определяли по отсутствию гибели птицы и клинических признаков болезни (угнетение, респираторные и нервные расстройства).

Молекулярно-генетические исследования. Обнаружение генома вируса ГП в биопробах и определение порогового цикла амплификации проводили в соответствии с «Методическими рекомендациями по выявлению РНК вируса гриппа птиц типа А методом ОТ-ПЦР в режиме реального времени»2.

Для отбора ротоглоточных проб использовали стерильные тупферы. Образцы отбирали через 6 сут после заражения от всех утят соответствующих групп. Определяли пороговые циклы амплификации (Ct) в контроле (Ct0) и в группах вакцинированных птиц (Cti). Реакцию считали положительной (геном вируса ГП Н5 присутствует), если 0 < Ct < 37 [21]. Далее проводили сравнение с контролем и вычисляли разность сопоставляемых величин (di = Cti – Ct0). Кроме этого, по групповым выборкам d рассчитывали средние оценки разности (D) и стандартные ошибки измерения средних (± m).

Иммуногенность вакцины «ВНИИЗЖ-АвиФлуВак» для уток определяли в лабораторных опытах по результатам устойчивости к контрольному заражению, по титрам сывороточных антител и по выделению вируса во внешнюю среду с индикацией в ПЦР.

Иммуногенность вакцины «ВНИИЗЖ-АвиФлуВак» для индеек определяли в лабораторных и производственных опытах по результатам устойчивости к контрольному заражению и по титрам сывороточных антител.

Иммуногенность вакцины «ВНИИЗЖ-АвиФлуВак» для гусей в производственных опытах определяли по титрам сывороточных антител.

Статистическая обработка полученных данных включала определение средних значений, ошибки среднего, статистической значимости различий между опытными группами животных с указанием значения статистического критерия, числа степеней свободы и величины вероятности ошибки прогноза (p).

В таблице 1 представлены результаты исследований в РТГА сывороток крови утят разного возраста на наличие антител к вирусу гриппа птиц Н5 после вакцинации.

Установлено, что суточные утята, вакцинированные в дозе 0,25 см3, вырабатывали антитела к вирусу ГП Н5 в низких неоднородных титрах (p > 0,05). В то же время титры антител к вирусу ГП Н5 в группе утят, привитых в дозе 0,5 см3, через 28 сут достигли значения 4,4 log2 при хорошей однородности (р ≤ 0,001).

У вакцинированных в возрасте 21 сут утят, независимо от дозы вакцины (0,5; 1,0 или 1,5 см3), антитела к вирусу ГП Н5 формировались в сопоставимых титрах. Сероконверсию в группах иммунизированных утят отмечали через 7 сут с максимальными значениями титров антител через 28 сут после вакцинации.

Статистическая обработка результатов первичных значений титров антител через 28 сут после вакцинации в экспериментальных группах была проведена методом однофакторного дисперсионного анализа в Excel. Было установлено, что статистика F-теста меньше критического значения F (Fтеста3,0 < Fкрит.3,4), то есть средние значения титров антител для трех групп не различались.

Для определения протективных свойств вакцины в отношении возбудителя ВГП Н5 вакцинированных уток заражали вирусом A/chicken/Stavropol/2077-6/21 H5N1. В таблице 2 представлены результаты эксперимента.

Установлено, что вакцинированные утята во всех опытных группах в течение 10 сут после заражения высоковирулентным вирусом ГП Н5N1 не заболевали. В группе невакцинированных птиц у 6 особей отмечали признаки болезни, одна из них пала.

Также для установления напряженности иммунитета у вакцинированных уток проводили исследования по выявлению экскреции вирулентного вируса. Задача данного этапа работы состояла в обнаружении в ротоглоточных выделениях птиц генома вируса ГП Н5 через 6 сут после заражения.

Выявили, что геном вируса ГП Н5 присутствовал во всех исследованных пробах. Однако относительно контроля исходная концентрация вирусного материала в ротоглоточных экскретах у вакцинированных птиц была существенно ниже. Так, пороговые циклы амплификации (Ct) в контрольной группе были в пределах 20,93–25,47 (в среднем – 23,83), в группе вакцинированных в дозе 0,5 см3 утят – в пределах 24,49–29,46 (в среднем – 26,84), в группе вакцинированных в дозе 1,0 см3 утят – в пределах 23,08–30,29 (в среднем – 27,5), в группе вакцинированных в дозе 1,5 см3 утят – в пределах 26,12–31,41 (в среднем – 28,32). Если принять, что один цикл амплификации приближенно соответствует удвоению количества целевого продукта, то в процентах от контроля исходная концентрация вирусного материала в тестируемой пробе может быть описана как J = (1/2D) × 100. Таким образом, соответственно вакцинированным группам искомые оценки составили (%): JI = 10,8; JII = 6,9 и JIII = 3,9, то есть вакцинированные в дозе 0,5 см3 утки выделяли вирус в 9 раз меньше, в дозе 1,0 см3 – в 14 раз меньше, а в дозе 1,5 см3 – в 26 раз меньше по сравнению с невакцинированными птицами.

Следовательно, вакцинация утят способствовала снижению вирусовыделения вакцинированными птицами по сравнению с невакцинированными, причем чем больше доза вакцины, тем снижение было более значимым.

Для определения протективных свойств вакцины в отношении возбудителя ВГП Н5 в лабораторных условиях вакцинированных индеек заражали вирусом A/chicken/Stavropol/2077-6/21 H5N1.

Из данных, представленных в таблице 3, видно, что устойчивость вакцинированных индеек к заражению в разных группах отличалась. Так, наибольшей устойчивостью обладали индейки, привитые вакциной в дозе 1,0 см3 (87,5%), а наименьшей – индейки, привитые в дозе 0,25 см3 (28,6%). Непривитые индейки пали через 3 сут после заражения.

Перед заражением определяли гуморальный поствакцинальный иммунный ответ у индеек. Было установлено, что в группе птиц, привитых в дозе 0,25 см3, средний титр антител составил 3,3 ± 0,6 log2, в группе привитых в дозе 0,5 см3 – 4,0 ± 0,6 log2, а в группе привитых в дозе 1,0 см3 – 4,9 ± 0,4 log2.

Таким образом, однократная вакцинация индеек в дозе 1,0 см3 вызывала формирование наиболее напряженного иммунного ответа к вирусу ГП Н5, что выражалось высокой протективной активностью (87,5% поголовья не заболевало) и образованием антител в высоких титрах.

Кроме лабораторных исследований проводили производственные испытания вакцины на промышленном поголовье индеек в Ставропольском крае.

Напряженность иммунитета индеек к вирусу ГП Н5 оценивали по титрам антител в РТГА через 35 сут после второй вакцинации. Было установлено, что средние титры антител в группе индеек, привитых двукратно в дозе 1,0 см3, составили 5,5 ± 0,2 log2, а в группе привитых в дозе 0,5 см3 – 3,5 ± 0,3 log2. Статистически полученные результаты различались с высокой степенью достоверности (99,9%).

На основании результатов лабораторных и производственных испытаний вакцины «ВНИИЗЖ-АвиФлуВак» на индейках были установлены оптимальные параметры ее использования, а именно: доза – 1,0 см3, кратность – не менее 2 раз.

Также проводили исследования по изучению иммуногенности вакцины на гусях в производственных условиях в Республике Башкортостан.

Из представленных в таблице 4 данных видно, что после однократной иммунизации вакцина вызывала образование антител к вирусу ГП Н5 у 48,5% поголовья гусей через один месяц после вакцинации в титре 3,7 log2, а через 2 мес. после иммунизации количество птицы с защитными титрами антител насчитывало только 23,3% и средний титр по группе составил 1,9 log2.

Как показали результаты исследований, минимальный защитный титр антител (≥ 5 log2) к вирусу ГП Н5 после двукратной вакцинации наблюдался у 22–27 из 30 птиц в течение 10 мес., то есть охват поголовья был на уровне 75,9–90,0%. Также в этот период и средние титры антител были на высоком уровне в пределах 6,3–6,8 log2.

Однократная прививка утят вакциной «ВНИИЗЖ-АвиФлуВак» в дозе от 0,5 до 1,5 см3 вызывала образование антител, выявляемых в РТГА, в титрах от 4,3 до 6,1 log2, что согласуется с данными, полученными D. Middleton [12]. Показано, что утята были устойчивы к заражению вирусом ГП Н5N1 через 28 сут после однократного применения вакцины «ВНИИЗЖ-АвиФлуВак» в дозах 0,5; 1,0 и 1,5 см3. Также стоит отметить, что исходная концентрация вирусного материала в ротоглоточных экскретах вакцинированных птиц была в 9–26 раз ниже относительно невакцинированных особей.

Таким образом, вакцина обладает высокой антигенной активностью, достаточной для формирования иммунитета утятами при введении в дозах от 0,5 до 1,5 см3. Также было установлено, что прививка суточных утят в дозе 0,25 см3 была недостаточной для защиты птицы.

Невакцинированные утята были менее чувствительны к заражению вирулентным вирусом Н5 клады 2.3.4.4b по сравнению с индейками, и у 60% особей наблюдали болезнь, что согласуется с данными A. Kandeil et al., которые сообщали о низкой чувствительности невакцинированных уток при заражении вирусом Н5 клады 2.2.1.2 H5N1 [10]. Этот факт свидетельствует о том, что утки-вирусоносители способны поддерживать резервуар возбудителя.

В лабораторных исследованиях было установлено, что для индеек оптимальной прививной дозой вакцины «ВНИИЗЖ-АвиФлуВак», при которой вакцинированные птицы были защищены от заражения на 87,5% и антитела формировались в наиболее высоких титрах (4,9 log2), является 1,0 см3.

В производственных условиях также показана эффективность вакцины при двукратном применении в дозе 1,0 см3, когда удавалось достигать высоких титров антител (5,5 log2) у промышленных индеек. Основываясь на данных, полученных в лабораторных и производственных условиях, было установлено, что доза 1,0 см3 является оптимальной для применения индейкам, а кратность прививки должна быть не менее 2 раз.

В производственных условиях на гусях испытывали две схемы применения вакцины «ВНИИЗЖ-АвиФлуВак», и было установлено, что в дозе 1,0 см3 при двукратном применении она обеспечивает иммунитет на протяжении 10 мес. у 75,9–90,0% поголовья птицы.

Полученные данные согласуются с выводами ряда ученых [8-11] и свидетельствуют, что для крупных и водоплавающих видов домашних птиц рационально применять вакцину «ВНИИЗЖ-АвиФлуВак» против ГП Н5 в двойной коммерческой дозе и как минимум двукратно с последующим контролем напряженности иммунитета и проведением ревакцинаций по показаниям.

1. 2 Андриясов А. В., Андрейчук Д. Б., Чвала И. А. Методические рекомендации по выявлению РНК вируса гриппа птиц типа А методом ОТ-ПЦР в режиме реального времени: № 45-16. Владимир: ФГБУ «ВНИИЗЖ»; 2016. 13 с.