Мастит, или воспаление молочной железы у коров, – наиболее распространенное заболевание молочных коров, наносящее ущерб сельскому хозяйству. Установлено, что около 150 различных видов/подвидов бактерий способны вызывать данное заболевание у крупного рогатого скота. Однако более 95% случаев маститов связаны с представителями только 10 групп микроорганизмов, включающих как условно-патогенные, так и патогенные, в зависимости от их резервуара и способа передачи [1]. К таким бактериям относятся Staphylococcus aureus, Mycoplasma spp., Streptococcus uberis, Streptococcus dysgalactiae, колиформные бактерии и другие грамотрицательные бактерии, такие как Escherichia coli и Klebsiella pneumoniae. Другие патогены, например Arcanobacterium pyogenes, различные стрептококки (Streptococcus parauberis, Streptococcus agalactiae, Streptococcus zooepidemicus), Corynebacterium bovis и Mycobacterium bovis, могут быть вовлечены в воспалительный процесс в меньшей степени [2].

Антибиотики считаются препаратами первого выбора при лечении данного воспалительного процесса. Однако проблема остаточного их содержания в продуктах животного происхождения и непрекращающегося роста устойчивости к противомикробным препаратам в дополнение к возможной передаче антибиотикорезистентных бактерий от животного к человеку приводит к введению ограничений на применение данных препаратов в ветеринарной медицине [3]. Разработка и внедрение новых классов антибиотиков может показаться наиболее очевидной стратегией, но после 1987 г. не было открыто ни одного нового класса антибиотиков, с этого времени используются лишь производные от уже существующих антибактериальных препаратов [4][5]. Разработка нескольких классов антибиотиков за короткий период времени привела к их чрезмерному использованию, а также к быстрому росту числа микроорганизмов, обладающих генами антибиотикорезистентности. В 1990-х гг. такие компании, как Pfizer, AstraZeneca и GlaxoSmithKline, проводили скрининг потенциально новых антибактериальных мишеней для разработки антибиотиков, однако в результате исследований не было найдено ни одного подходящего кандидата [6]. Исследования фармацевтических компаний направлены на модифицирование уже существующих классов антибиотиков, а не на разработку потенциально новых [7]. В связи с этим в настоящее время существует необходимость в поиске альтернативных средств для профилактики и борьбы с маститами у коров.

Цель данного обзора – дать представление о последних открытиях в области альтернативных средств, включающих пробиотики, бактериоцины, бактериофаги (фаги) и фаговые ферменты, наночастицы, экстракты трав, эфирные масла и иммунобиологические препараты (вакцины), для профилактики и лечения мастита коров. Систематизированные и обобщенные сведения с указанием литературных источников по рассматриваемой в обзоре теме [8–42] представлены в виде таблицы 1 в разделе «Дополнительные файлы» по адресу: https://doi.org/10.29326/2304-196X-2024-13-3-203-213.

Согласно современным представлениям, развитию мастита способствует дисбаланс микробиоты молочной железы, поэтому пробиотики рассматриваются в качестве альтернативных средств профилактики и терапии. Интрамаммарная инокуляция пробиотиков – бактерий, продуцирующих молочную кислоту, –приводит к их колонизации в вымени [43]. Механизмы действия пробиотиков против патогенных микроорганизмов сводятся к следующему: адгезия к эпителиальным клеткам, агрегация и коагрегация, образование биопленок, колонизация, продукция биосурфактантов и/или антагонистических метаболитов (органических кислот, перекиси водорода, бактериоцинов), конкуренция за питательные вещества и/или производство ферментов [11]. Пробиотические бактерии могут быть использованы для контроля воспалительных процессов, в особенности в сухостойный период, за счет антагонистической активности в отношении этиологических агентов мастита и посредством иммуномодуляции, а именно воздействуя на развитие, дифференцировку и эффекторные функции широкого спектра субпопуляций иммунных клеток, а также клеток эпителия [11][44-46]. Помимо интрамаммарного применения, пробиотики также могут применяться и в качестве дезинфектантов – средств для обработки сосков до и после доения [9][47].

Современные исследования посвящены изучению пробиотиков для профилактики и лечения мастита, содержащих Lactococcus lactis, Lactobacillus perolens, Lactobacillus paracasei, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus casei, Lactobacillus rhamnosus, Schleiferilactobacillus perolens, Bifidobacterium breve, Bacillus subtilis.

Многие ученые отмечают потенциал пробиотиков в отношении наиболее распространенных возбудителей мастита: S. aureus, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus chromogenes, Staphylococcus intermedius, S. agalactiae, S. dysgalactiae и E. coli [8], однако в основном данные исследования были проведены in vitro. Механизм действия многих молочнокислых бактерий в качестве пробиотиков заключается в ингибировании агрегации бактериальных патогенов к эпителиальным клеткам молочной железы (MAC-T) [19] и секреции противомикробных веществ (бактериоцинов) [9].

Исследователи из Аргентины изучали 12 видов молочнокислых бактерий, из них два вида, L. lactis subsp. lactis CRL 1655 и L. perolens CRL 1724, обладали способностью к адгезии к эпителиальным клеткам молочной железы, ингибированию и коагрегации 15 штаммов S. aureus. Pellegrino M. et al. рекомендуют в сухостойный период для профилактики мастита интрамаммарно вводить коровам данные пробиотики для активации иммунного ответа путем запуска продукции специфических антител [11].

Другой особенностью некоторых лактобацилл является продукция собственных биопленок. Штаммы L. rhamnosus АТСС 7469 и L. plantarum 2/37 обладают способностью разрушать патогенные стафилококковые биопленки и вытеснять их собственными [12].

При колиформном мастите ученые из Китая [15] отмечают эффективность пробиотика на основе L. rhamnosus GR-1. Данный штамм молочнокислых бактерий блокирует продукцию активных форм кислорода и опосредует активацию митофагии, тем самым ингибируя индуцированную E. coli сборку инфламмасомы NLRP3, семейства рецепторов NLR (NOD-подобных рецепторов), которая вызывает апоптоз эпителиальных клеток молочной железы. Таким образом, применение пробиотика способствует активации митофагии и сохранению митохондриальной функции клеток.

В исследовании M. Qiu et al. для изучения механизма действия Enterococcus mundtii H81 при воспалении молочной железы в качестве модели использовали мышей с маститом, индуцированным S. aureus. Показано, что E. mundtii H81 способен ингибировать рост S. aureus. Штамм H81 защищает целостность эпителиального барьера молочной железы. В результате продемонстрировано, что E. mundtii H81 уменьшает патологическое повреждение ткани молочной железы, снижая секрецию провоспалительных цитокинов и ингибируя активацию сигнального пути транскрипционного ядерного фактора NF-κB. Следовательно, E. mundtii H81 может иметь потенциал в качестве многообещающего кандидата для лечения мастита, вызванного S. aureus [17].

Ряд исследований направлен на изучение пробиотического потенциала молочнокислых бактерий для лучшего понимания того, как данные свойства могут быть использованы для борьбы с возбудителями мастита крупного рогатого скота in vivo.

При лечении различных форм мастита интрамаммарное введение пробиотического штамма L. lactis оказалось столь же эффективным, как и применение обычной формы антибиотика. При этом лактококки полностью элиминировались из обработанной железы через несколько дней. Многие исследователи предполагают, что реконвалесценция происходит вследствие индуцированного локального воспаления, интенсивного привлечения лейкоцитов и стимуляции защиты молочной железы [9][10][13].

Catozzi С. et al. [14] исследовали интрамаммарное введение L. rhamnosus у буйволов с субклинической формой мастита и наблюдали провоспалительную активность и модификацию микробиоты молока. Обработка L. rhamnosus вызывала сильную хемотаксическую реакцию, определяемую значительным увеличением лейкоцитов в молоке. При анализе микробиоты обнаружено изменение относительной численности представителей некоторых родов, таких как Pseudomonas spp. и 5-7N15. Вначале наблюдалось увеличение количества соматических клеток в молоке, однако через 6 дней этот показатель значительно уменьшился. Схожая реакция наблюдалась и при интрамаммарной инфузии B. breve [16]. В связи с этим необходимы дальнейшие исследования для оценки потенциального использования GRAS бактерий (Generally Recognized as Safe, в целом признанные безопасными) в качестве поддерживающей терапии против мастита.

Одним из способов применения пробиотических штаммов для профилактики и лечения мастита является пероральная подкормка. Как показано M. Urakawa et al., введение в рацион кормовой добавки на основе B. subtilis C-3102 приводит к значительному снижению заболеваемости маститом, а также поддержанию среднего значения соматических клеток в молоке на уровне, существенно более низком, чем в контрольной группе. Кроме того, в опытной группе наблюдался более низкий уровень кортизола и реактивных соединений тиобарбитуровой кислоты, следовательно, организм коров не претерпевал окислительного стресса. Результаты проточной цитометрии показали увеличение доли CD4+ T-клеток и CD11c + CD172ahigh дендритных клеток в крови. Дендритные клетки – антигенпрезентирующие клетки, специализирующиеся на поглощении и процессинге антигена, играющие важную роль во врожденных и адаптивных иммунных реакциях. Данные результаты показывают, что B. subtilis C-3102 можно применять в качестве профилактики мастита у коров [18].

В целом исследования, изложенные выше, показывают, что пробиотические штаммы бактерий обладают большим потенциалом для создания эффективных средств для лечения и профилактики мастита, однако еще предстоит выяснить их успешность при лечении клинической формы заболевания.

Бактериоцины представляют собой бактериальные пептиды, синтезируемые на рибосомах, обладающие антимикробной активностью против других бактерий, включая устойчивые к антибиотикам штаммы [44]. Некоторые бактериоцины (например, низин, продуцируемый L. lactis) уже используются для консервирования пищевых продуктов благодаря их антимикробной эффективности и в то же время высокой степени безопасности для потребителей [3]. На практике применяются либо очищенные бактериоцины, которые вводят непосредственно в чистом виде, либо жизнеспособные бактерии, продуцирующие бактериоцины (в основном молочнокислые) [13]. Чувствительность бактерий к бактериоцинам обусловлена их взаимодействием с бактериальной клеточной поверхностью и клеточной мембраной. Пермеабилизация клеток и образование пор являются основным механизмом, с помощью которого бактериоцины атакуют бактерии-мишени. Поскольку два бактериальных свойства (поверхностный заряд плазмолеммы и текучесть мембраны) используются в качестве мишени для бактериоцинов, изменение данных свойств делает бактериоцины неэффективными, что приводит к развитию резистентности к бактериоцинам [48]. Однако данную устойчивость можно преодолеть, используя их комбинации [49] друг с другом или с другими противомикробными соединениями [50]. Кроме того, эффективность бактериоцинов может быть увеличена с помощью биоинженерии. Поскольку, в отличие от антибиотиков, бактериоцины представляют собой пептиды, синтезированные на рибосомах, их аминокислотные остатки могут быть изменены, что индуцирует их противомикробный эффект. Бактериоцины в основном принято разделять на 3 класса (табл. 2) [48].

Таблица 2Классификация бактериоциновTable 2Classification of bacteriocinsКлассХарактеристикаПродуцентыПример бактериоцинаМеханизм действияIIaЛантибиотики (пептиды с молекулярной массой < 5 кДа, содержащие лантионини β-метиллантионин)L. lactisНизинПермеабилизация клеток и образование пор, рецептор липид II, действие против грам(+) бактерийIbКарбоциклические лантибиотики, содержащие лабиринтин и лабионинActinomadura namibiensisЛабиринтопептин А1Действие против вируса простого герпеса и вируса иммунодефицитаIcСактибиотики (серосодержащие антибиотики, содержащие α-углерод)Bacillus thuringiensisТурицин CDДействие против грам(+) бактерийIIIIaНебольшие термостабильные пептиды, синтезированные в форме предшественника, процессированного после двух остатков глицинаPediococcus pentosaceus, Pediococcus acidilactici, LactobacillussakeiПедиоцин ПА-1, сакацины А и Р, лейкоцин АПермеабилизация клеток и образование пор, рецептор пермеазы маннозы. Действие против грам(+) и грам(–) бактерий, активны против листерийIIbДвухкомпонентные системы: два разных пептида, необходимые для образования активного комплекса для формирования порL. lactis subsp. cremoris, L. plantarumЛактококцины G, плантарицин EFи плантарицин JKПермеабилизация клеток и образование пор, рецептор UppP (ундекапренил-пирофосфат-фосфатаза), действие против грам(+) бактерийIIcЦиркулярные бактериоциныLactobacillus gasseri, E. faecalis, Lactococcus garvieaeГассерицин А, энтероцин AS-48,гарвицин МЛПермеабилизация клеток и образование пор, рецептор ABC-транспортер, действие против грам(+) бактерийIIdНемодифицированные, линейные, нелидерные, непедиоциноподобные бактериоциныLactobacillus salivarius, L. lactis subsp. lactisБактофенцин А, LsbBПермеабилизация клеток и образование пор, рецептор металлопептидаза, действие против грам(+) бактерийIIIБольшие молекулы, чувствительные к теплуLactobacillus crispatus, Lactobacillus helveticus, E. faecalisГельветицин М, гельветицин J и энтеролизин АПермеабилизация клеток и образование пор, действие против грам(+) и грам(–) бактерий

Для лечения мастита у крупного рогатого скота разработан препарат, содержащий бактериоцин, продуцируемый Streptococcus equinus HC5. Бовицин HC5 имеет некоторое сходство с низином по механизму действия, поскольку он способен связываться с липидом II в цитоплазматической мембране. Бразильские ученые исследовали активность бовицина HC5 в отношении чистых или смешанных культур штаммов стафилококков, стрептококков и эшерихий, выделенных от коров с диагнозом «мастит» в различных молочных стадах, и подтвердили его способность ингибировать рост более 80% протестированных изолятов стрептококков и стафилококков, однако отметили, что антимикробного эффекта против штаммов E. coli не наблюдалось [20].

Ученые из Таиланда изучили антимикробный потенциал пептида Pm11, имеющего нерибосомальное происхождение. Этот пептид производится из плеуроцидина, относящегося к семейству катионных α-спиральных пептидов, обнаруженного у Pleuronectes americanus. В данном исследовании пептид Pm11 оказался активен в отношении штаммов E. coli SCM1249, S. aureus CM967, S. agalactiae SCM1084 и S. uberis SCM1310. Однако против штамма Klebsiella spp. SCM1282 антимикробной активности не наблюдалось из-за наличия у данных микроорганизмов внеклеточной полисахаридной капсулы. Когда пептид взаимодействует с бактериальной капсулой, происходят его структурные изменения, вызывающие секвестрацию, вследствие чего пептид не достигает мембраны-мишени патогена [21].

Гарвицин представляет собой бактериоцин класса II, продуцируемый штаммами L. garvieae [24]. Норвежские ученые выявили ингибирующую способность гарвицина KS против Acinetobacter baumannii. При совместном применении с низином гарвицин также ингибирует рост S. aureus [25].

В другом исследовании бразильские ученые изучали антагонистическую активность ауреоцина 4181, стафилококцина, продуцируемого S. aureus. Данный бактериоцин оказался эффективным против широкого спектра грамположительных бактерий, включая другие штаммы стафилококков и стрептококков [26]. Бактерицидный механизм действия ауреоцина связан с разрушением клеточных мембран патогенных возбудителей мастита [51].

Бактофенцин А был выделен из грамположительных L. salivarius [52] и продемонстрировал ингибирующую активность в отношении S. aureus и Listeria monocytogenes путем воздействия на клеточную стенку бактерий [22]. Низин А, лантибиотик, продуцируемый L. lactis, проявляет активность широкого спектра против грамположительных бактерий. Механизм его действия основан на разрушении клеточной стенки бактерий путем образования пор и ингибирования биосинтеза важных предшественников клеточной стенки. В присутствии глицерина Lactobacillus reuteri генерирует активный альдегид, известный как реутерин. Было показано, что это соединение эффективно против широкого спектра грамположительных и грамотрицательных бактерий, поскольку вызывает окислительный стресс в клетках. В нескольких исследованиях оценивался потенциал реутерина в качестве пищевого консерванта [53] и дезинфицирующего средства [54]. Канадские ученые изучали антибактериальное действие бактериоцинов бактофенцина А, низина и реутерина как по отдельности, так и в комбинации, применяя их в качестве средства для обработки сосков вымени до и после доения. В результате проведенных исследований установлено, что использование бактофенцина А не снизило содержания стафилококков и стрептококков на поверхности кожи сосков вымени; низин и реутерин, наоборот, уменьшили бактериальную обсемененность. При комбинированном применении данных бактериоцинов наблюдали наиболее выраженный антибактериальный эффект, аналогичный биоцидному действию низина и йода. Таким образом, совместное использование нескольких бактериоцинов обладает множеством преимуществ [23]. Xu Х. et al. было продемонстрировано, что для ингибирования роста бактерий необходимы более низкие концентрации противомикробных препаратов, обладающих синергическим действием [55]. Следовательно, снижается стоимость лечения, а также риск побочных эффектов, вызванных токсическим действием лекарственного средства [23]. Кроме того, бактериоцины можно применять совместно с антибактериальными препаратами. Например, низин А повышает активность цефазолина, тем самым позволяя снизить дозу антибиотика при лечении мастита. Такая комбинация эффективна в отношении S. aureus, S. intermedius, S. agalactiae, S. dysgalactiae, Enterococcus faecalis и E. coli [24].

Наряду с активным открытием новых бактериоцинов, их разработкой и сочетанием с другими бактерицидными агентами неизбежно возрастает и резистентность к данным препаратам. Также стоит учитывать возможную гепатотоксичность данных бактериальных пептидов [48]. В целом следует рассмотреть различные подходы для решения проблемы резистентности и снижения токсичности бактериоцинов, которые обладают огромным потенциалом в качестве биоконсервантов и терапевтических средств.

Бактериофаги (фаги) специфически инфицируют бактерии, что приводит либо к лизису бактериального агента (литические или вирулентные фаги), либо к лизогении – интеграции генетического материала бактериофага в бактериальную хромосому хозяина (умеренные или симбиотические фаги) [56]. Бактериофаги, благодаря специфичности действия, вызывают минимальное нарушение нормального микробиома животных, тем самым не вызывая дисбактериоз [57]. Подобная избирательность бактериальных мишеней фагами достигается за счет распознавания специфических рецепторных белков, располагающихся в клеточной стенке бактерии, на которых фаг адсорбируется с помощью специализированных фибрилл, после чего бактериофаги проникают и высвобождают свой генетический материал в бактериальной клетке [58]. Как правило, фаги большинства штаммов S. aureus взаимодействуют в клеточной стенке с тейхоевой кислотой, которая отличается от других кислот, присущих коагулазонегативным стафилококкам [59]. Для исследований по поиску бактериофагов, действующих против одного из основных возбудителей мастита – золотистого стафилококка, используют следующие основные домены, расположенные в последовательностях эндолизина: цистеин, гистидинзависимая амидогидролаза/пептидаза (CHAP), амидаза 2 (N-ацетилмурамоил- L-аланинамидаза) и SH3b для распознавания клеточной стенки патогенного агента [60].

Вслед за успешной адсорбцией и проникновением внутрь клетки литические фаги захватывают механизм репликации ДНК бактерии для синтеза собственного генетического материала и структурных белков в латентный период. Продолжительность периода, необходимого для начала синтеза, варьирует у бактериофагов, действующих против возбудителей мастита крупного рогатого скота, и может составлять 5 (E. faecalis), 10 (S. aureus), 20 (Pseudomonas aeruginosa) или 30 мин (S. agalactiae) [61-64]. Впоследствии, после синтеза вируса, многочисленные фаговые частицы собираются и в конечном итоге высвобождаются в результате лизиса бактериальной клетки за счет совместной активности ферментов эндолизина и холина, которые разрушают клеточную стенку бактерий [57]. При мастите крупного рогатого скота количество фаговых частиц, синтезированных и высвобождаемых на одну бактериальную клетку, варьирует от 20 до 100 БОЕ/кл. (бляшкообразующих единиц на 1 клетку) в течение приблизительно 175 мин [61-64]. Способность литических фагов в конечном итоге лизировать бактерии и размножаться после инфицирования обеспечивает уничтожение бактериальных патогенов, а также постоянное увеличение концентрации инфекционных фагов (автодозирование) в очаге инфекции [65]. Кроме того, короткое время репликации, демонстрируемое фагами, позволяет сократить сроки разработки препаратов, предоставляя возможность быстрого индивидуального лечения, направленного на конкретные штаммы бактерий [57].

Во многих исследованиях отмечается значительное снижение бактериальной нагрузки при воздействии бактериофага на патогенные агенты, вызывающие мастит [27-31]. Однако уже через 2 ч после обработки бактериофагом была обнаружена резистентность к ним, о чем свидетельствует возобновление роста культур после лизиса, что может отрицательно влиять на терапевтическую эффективность [28]. Чтобы ограничить развитие резистентности и лизогении, увеличить специфичность таргетной мишени, а также повысить эффективность лизиса, можно оптимизировать состав фагового коктейля [66][67].

Например, I. Titze and V. Krömker исследовали эффективность воздействия смеси бактериофагов и L. plantarum на изоляты S. aureus, выделенные из молока коров с воспалением молочной железы. Фаговый коктейль, а также его комбинация с молочнокислыми бактериями продемонстрировали высокую антимикробную активность в отношении S. aureus в течение 24-часового периода инкубации при 37 °C. Статистические расчеты показали, что только смесь бактериофагов оказывала значимое влияние на интенсивность роста S. aureus [32].

В исследовании китайских ученых антибактериальную активность смеси бактериофагов оценивали непосредственно опытным путем. Для этого были отобраны восемь лактирующих коров голштинской породы, которых случайным образом разделили на четыре группы по две головы в каждой. Три группы коров подверглись интерцистернальному заражению 60 КОЕ E. coli ECD2, суспендированными в 1 мл апирогенного фосфатно-солевого буферного раствора (PBS). Фаговый коктейль готовили путем смешивания в соотношении 1:1:1 действующих против кишечной палочки фагов SYGD1, SYGE1 и SYGMH1 с начальной концентрацией около 1010 БОЕ/мл. Смесь разбавляли в 100 раз, используя PBS. Одной группе вводили интрамаммарно 5 мл цефтиофура натрия (600 мг/мл), второй – интрамаммарно 5 мл смеси фагов (1 × 108 БОЕ/мл), третьей – интрамаммарно 5 мл PBS. Все препараты инокулировали один раз в день в течение трех дней. Животные четвертой, контрольной, группы не подвергались ни заражению, ни лечению. Показано, что все три бактериофага перспективны в качестве антимикробных агентов. В особенности при использовании в смеси терапия позволяет снизить количество бактерий, соматических клеток и воспалительных факторов, облегчить симптомы мастита у крупного рогатого скота и достичь того же эффекта, что и при лечении антибиотиками [33].

Возбудители, вызывающие мастит, способны образовывать биопленки, что ограничивает доступ антибиотиков к бактериям [68-70]. Однако фаги могут предотвращать образование биопленок или проникать в бактериальные патогены in vitro и in vivo, что свидетельствует о возможности их использования в качестве самостоятельного лечения или в комбинации с антибиотиками для повышения терапевтической эффективности [28][69]. В исследовании иранских ученых бактериофаг М8 проявил заметную литическую активность в отношении всех тестируемых типов S. aureus (мультирезистентных, метициллинрезистентных и биопленкообразующих штаммов). Данный бактериофаг имеет потенциал для терапевтического применения при трудноизлечимых воспалительных заболеваниях молочной железы, вызванных S. aureus, отдельно или в сочетании с другими фагами и антибиотиками [34].

Результаты многих исследований in vitro и in vivo показывают, что фаготерапия является многообещающей альтернативой антибиотикам для лечения мастита у коров, а в сочетании с противомикробными препаратами позволит снизить дозу последних или сократить курс лечения [71]. Однако эффективность фаговой терапии ограничена из-за их строгой специфичности к определенным наборам штаммов возбудителей мастита и необходимости использования нескольких фагов для контроля множества бактериальных патогенов. Фаготерапия оказывается наиболее эффективной, когда целевой патоген легко доступен и присутствует в больших количествах [72].

Одним из путей решения недостатков фаготерапии может быть применение очищенных продуктов фаговых генов, таких как лизины. Эндолизины (амидаза, эндопептидаза, глюкозидаза и трансгликозилаза), широко известные как энзибиотики, представляют собой муреолитические ферменты, образующиеся во время литического цикла бактериофага [73]. Они воздействуют на связи пептидогликана и лизируют бактерии изнутри, способствуя высвобождению новых фагов. Эндолизины обладают более широким антибактериальным спектром по сравнению с фагами. Кроме того, они также могут лизировать бактерии при экзогенном применении. Эндолизины специфичны, высокоактивны и несут меньший риск развития резистентности [74].

К хорошо изученным и наиболее активным лизинам относится стрептококково-специфичный лизин PlyC, полученный из бактериофага C1. Хотя почти все описанные на сегодняшний день грамположительные эндолизины кодируются одним геном, эндолизин PlyC фага C1 стрептококка группы А является единственным примером мультимерного лизина, состоящего из двух разных генных продуктов: PlyCA и PlyCB. Одна субъединица PlyCA, обладающая ферментативной активностью, и восемь субъединиц PlyCB, составляющих домен связывания клеточной стенки, образуют полный комплекс PlyC, который представляет собой эндолизин с самой высокой активностью, всего один нанограмм способен уничтожить 107 КОЕ различных видов стрептококков за несколько секунд [3][35][75].

Возможность применения эндолизинов стрептококковых фагов λSA2 и B30 в качестве противомаститных средств изучали в 2015 г. M. Schmelcher et al. Лизин λSA2 показал высокую активность в коровьем молоке против S. dysgalactiae, S. agalactiae и S. uberis, тогда как лизин B30 был менее эффективен. На модели мастита у мыши оба фермента значительно снижали концентрацию всех трех видов стрептококков (за исключением B30 по отношению S. dysgalactiae). Стоит отметить, что синергетический эффект, обнаруженный для двух ферментов in vitro, не наблюдался на мышиной модели. В целом полученные результаты демонстрируют потенциал эндолизинов для лечения мастита крупного рогатого скота, вызванного стрептококком [36].

В исследовании китайских ученых показано, что эндолизин LysKΔamidase способен ингибировать 71 метициллин-чувствительный и 66 метициллин-резистентных штаммов стафилококка, выделенных из молока коров с маститом. Широкая антистафилококковая активность данного фермента in vitro, в том числе против стафилококков со множественной лекарственной устойчивостью, а также стафилококков, продуцирующих биопленки, свидетельствует о том, что LysKΔamidase может стать средством борьбы с трудноизлечимыми воспалительными заболеваниями молочной железы [37].

Однако количество клинических исследований по применению эндолизинов для лечения мастита крупного рогатого скота ограничено. В одном из таких экспериментов J. Fan et al. вводили интрамаммарно 20 мг эндолизина Trx-SA1 коровам с начальной стадией клинического мастита один раз в день в течение 3 дней. В 60% случаев в пробах молока отмечалось снижение общего количества S. aureus и количества соматических клеток [38].

Несмотря на многообещающие перспективы применения эндолизинов в качестве терапевтического средства при мастите, их использование требует дальнейшего изучения, так как существует ряд ограничений. Например, повторное введение лизирующих белков приводит к образованию иммуноглобулинов против введенных фаговых ферментов, которые ограничивают антимикробную активность последних [44]. Кроме того, большинство эндолизинов не активны в отношении грамотрицательных бактерий, поскольку внешняя мембрана защищает лежащие в ее основе углеводы и пептидогликан от прямого контакта с лизинами. Тем не менее одним из основных преимуществ использования бактериофагов и фаговых эндолизинов является их способность элиминировать устойчивые к антибиотикам патогены, против которых обычные терапевтические методы неэффективны [38].

Помимо вышеперечисленных средств терапии и профилактики мастита, к сравнительно новым стратегиям борьбы относится использование наночастиц, экстрактов трав и эфирных масел.

Наночастицы обладают противомикробным потенциалом широкого спектра действия и не влияют на развитие резистентности у бактерий. Антимикробное действие наночастиц металлов объясняется: 1) высвобождением образующегося активного кислорода; 2) перекисным окислением бактериальных белков и липидов; 3) проникновением углеводов внутрь бактериальных клеток; 4) деградацией микробной ДНК; 5) повреждением клеточной мембраны и, как следствие, увеличением ее проницаемости [76][77]. После воздействия на бактерии наночастиц отмечено снижение активности лактатдегидрогеназы и уровня аденозинтрифосфата, что указывает на неэффективную регуляцию энергии у возбудителей мастита. Также наблюдается нарушение экспрессии генов у патогенов, включая гены, кодирующие глутатион (glutathione, GSH), глутатион-S-трансферазу (glutathione S-transferase, GST), супероксиддисмутазу (superoxide dismutase, SOD) и каталазу (catalase, CAT), что приводит к гибели бактерий [77]. Результаты, полученные в ходе пилотных исследований, показали, что наночастицы меди ингибируют рост S. aureus и проявляют минимальную токсичность в отношении клеточных линий фибробластов при концентрации 6,25 мкг/мл. Внутримышечное введение наночастиц меди крысам при мастите, вызванном золотистым стафилококком, оказалось более эффективным, чем инъекции гентамицина, данные выводы были сделаны на основании клинических признаков, результатов определения общей бактериальной нагрузки и исследования гистологических препаратов [39].

Однако, поскольку использование наночастиц при лечении мастита еще не получило широкого распространения в качестве альтернативы классическому подходу с применением антибиотиков, многие исследователи предпочитают комбинированную терапию наночастицами с противомикробными средствами. Уже известно, что интрамаммарное введение препарата с наносеребром и цефтиофуром имеет терапевтическую эффективность до 93,33% случаев. Данную комбинацию также можно использовать в профилактических целях, например, перед отелом [78].

Применение растительных экстрактов и эфирных масел при лечении мастита достаточно перспективное направление исследований, так как, по сравнению с антибиотиками, данные препараты имеют натуральный состав, у них отсутствуют тяжелые побочные эффекты [79], также растительные компоненты не участвуют в формировании резистентности у бактерий при длительном применении [80]. Об этом методе лечения мастита у продуктивных животных известно уже давно, в традиционной китайской медицине использовались экстракты таких растений, как Taraxacum mongolicum, Lonicera japonica, Viola patrinii, Folium isatidis, Angelica dahurica, Coptis chinensis, Phellodendron amurense, Rheum officinale, Scutellaria baicalensis, которые обладают детоксикационным, противовоспалительным и антибактериальным действием [3]. Однако механизм действия большинства экстрактов и эфирных масел до конца не выяснен [81]. Например, противомикробную активность подобных препаратов обеспечивают различные вторичные метаболиты растений, среди них геранилацетат, эвгенилацетат, транс-коричный альдегид, ментол, карвакрол, тимол, гераниол, эвгенол, п-цимен, лимонен, терпинен и карвон [82].

Механизм действия растительных экстрактов и эфирных масел на бактериальную клетку, вероятно, связан с деградацией клеточной стенки, повреждением цитоплазматической мембраны и ее белков, высвобождением клеточного содержимого, коагуляцией цитоплазмы и дестабилизацией движущей силы протонов [82]. Грамположительные бактерии более восприимчивы к эфирным маслам, чем грамотрицательные, возможно потому, что последние имеют толстый слой липополисахаридов во внешней мембране, которая покрывает клеточную стенку, ограничивая диффузию гидрофобных соединений [83].

Многие исследования подтвердили эффективность этих растительных производных против бактерий, вызывающих воспаление молочной железы у крупного рогатого скота. Например, ученые из Пакистана методом диффузии в агар изучали антибактериальное действие Allium sativum, Bunium persicum, Oryza sativa и Triticum aestivum против штаммов таких наиболее распространенных возбудителей мастита, как S. aureus, E. coli и K. pneumoniae. Было обнаружено, что все экстракты значительно ингибируют (p < 0,01; p < 0,05) рост бактериальных штаммов [40]. В другом исследовании M. F. Cerioli et al. определяли ингибирующее действие эфирного масла Minthostachys verticillata и лимонена на образование биопленок у изолятов E. coli, Bacillus pumilus и Enterococcus faecium, выделенных от крупного рогатого скота с признаками воспаления молочной железы. Полученные результаты показали, что действие эфирных масел более эффективно, чем лимонена, который не проявил бактерицидной активности против E. faecium [41]. Сербские исследователи изучали антибактериальную активность эфирных масел Thymus vulgaris L., Thymus serpyllum L., Origanum vulgare L. и Satureja montana L. при лечении мастита. Для этого опытной группе лактирующих коров в пораженные маститом доли вымени вводили по 15 мл препарата, в состав которого входили эфирные масла. При сравнении общей бактериальной нагрузки в пробах молока до и после лечения оказалось, что данный препарат эффективно ингибировал рост Staphylococcus spp., Streptococcus spp., Klebsiella spp., Proteus mirabilis, E. coli, S. uberis, Serratia marcenses. Доминирующими соединениями в полученном препарате были тимол и карвакрол. Количественное определение этих двух соединений в оцениваемых биологических образцах показало, что период их выведения составляет 24 ч [42].

Однако существуют некоторые аспекты, которые считаются ограничивающими использование растительных экстрактов и эфирных масел для лечения мастита крупного рогатого скота. Таким образом, исследования должны быть направлены на поиск методов экстракции в промышленных масштабах, методов преобразования растительных экстрактов или эфирных масел в концентрированные и однородные продукты и способов применения таких препаратов.

Во многих странах благополучие сельскохозяйственных организаций обеспечивается использованием аутогенных вакцин, в основном для профилактики заболеваний, вызванных S. aureus и Mycoplasma bovis, в меньшей степени – S. uberis. Данные препараты готовятся из изолятов, выделенных в хозяйстве от коров с маститом, а затем применяются всему стаду. Кроме того, также доступны коммерческие аутогенные вакцины против мастита, например Bestvac® из штаммов S. aureus (IDT, Германия) [84]. В промышленных масштабах выпускаются моно- и поливалентные препараты. Коммерчески доступные вакцины против колиформного мастита включают: 1) Enviracor® J-5 – содержит мутантный штамм J-5 E. coli (Zoetis, США), вводят подкожно трехкратно (при запуске, через 4 недели после запуска и в течение 2 недель после отела); 2) J-VAC® E. coli – бактерин-анатоксин E. coli мутантного штамма J-5 (Merial, Германия), вводится подкожно или внутримышечно двукратно (при запуске и через 2–4 недели); 3) ENDOVAC-Dairy® – бактериновый анатоксин, полученный из мутанта Re-17 Salmonella typhimurium (Endovac Animal Health LLC, США), обеспечивает защиту от таких патогенов, как E. coli, Salmonella, Pasteurella и Mannheimia, вводится внутримышечно двукратно (при запуске и через 2–3 недели). Также доступны вакцины, эффективные против S. aureus, например Lysigin® (Boehringer Ingelheim, Германия), которая вводится подкожно в интрамаммарный лимфатический узел молочной железы трехкратно (за 4 недели, затем за 2 недели до отела, ревакцинация – через 6 месяцев).

Помимо аутогенных вакцин для профилактики мастита применяются инактивированные препараты. Поливалентная вакцина STARTVAC® (Hipra, Испания) содержит E. coli (штамм J-5) и S. aureus CP8 (штамм SP 140) [85], вводится внутримышечно трехкратно (за 45 дней до отела, за 10 дней до отела, через 62 дня после второй вакцинации). Что касается отечественных разработок, вакцина «МаститВак-ЕВА» (ФГБУ «ВНИИЗЖ», г. Владимир) состоит из инактивированных бактериальных клеток S. agalactiae, S. dysgalactiae, S. uberis, двух штаммов S. aureus, Staphylococcus hyicus и двух штаммов E. coli. Для создания первичного иммунного фона к основным клинически значимым возбудителям маститов рекомендуется вакцинировать телок с 20–22-недельного возраста, повторно – через 2 недели, ревакцинацию – через каждые 6 месяцев.

Несмотря на то что доступны различные коммерческие вакцины против мастита, ни одна из них не обеспечивает полную защиту, а кроме того, не является экономически эффективной [43]. Имеются данные об исследованиях, при проведении которых не выявлено существенных различий в частоте возникновения мастита и содержании соматических клеток в молоке контрольной группы коров и опытных групп вакцинированных животных [86]. Недостаточный защитный потенциал может быть объяснен многими факторами: возрастом, состоянием здоровья, различным иммунным ответом у отдельных животных в зависимости от генетических и экологических условий [3][87][88].

Таким образом, основная часть приведенных литературных данных показала возможность использования новых терапевтических подходов для преодоления ограничений традиционной терапии на основе антибиотиков. Однако для большинства из альтернативных средств тестирования проведены только in vitro, дополнительные исследования, в основном осуществляемые in vivo, все еще отсутствуют, хотя они являются критически важными и необходимыми. Рассмотренные методы лечения, вероятно, не смогут полностью заменить антибиотикотерапию. Наиболее рациональным решением будет совместить традиционные схемы лечения антибактериальными препаратами с новыми подходами, это позволит сократить длительность применения антибиотиков и периода ожидания для молока, что, в свою очередь, увеличит продуктивность и снизит вероятность возникновения резистентных штаммов бактерий. Не стоит забывать и о профилактике мастита крупного рогатого скота посредством улучшения качества жизни и условий содержания животных, дезинфекции сосков вымени до и после доения, своевременного технического обслуживания доильных аппаратов, что является общепринятыми мерами по предотвращению возникновения новых случаев мастита.