Проблемами эффективной и безопасной специфической профилактики болезней животных занимаются ученые всего мира. Несмотря на достигнутые успехи в производстве вакцин, поиск экономически выгодного, безопасного адъюванта, который бы способствовал усилению иммунного ответа, актуален по сей день.

Современные адъюванты должны повышать иммунный ответ (клеточный и/или гуморальный), легко метаболизироваться в организме и быть доступными для массового применения [1][2].

В настоящее время в мире ведется активное изучение свойств хитозана [3–20]. Его производные широко применяются в фармацевтической промышленности и в ветеринарии. Препараты на основе хитозана проявляют множество биологических эффектов, включая антимикробную и гипохолестеринемическую активность при доставке лекарств. С их помощью увеличивают скорость диссоциации плохо растворимых лекарственных средств, повышают степень их всасывания, регулируют высвобождение лекарственных веществ и создают препараты пролонгированного действия [2]. Также отмечено, что раствор хитозана усиливает как гуморальный, так и клеточный иммунный ответ при подкожном введении вакцин [15]. Также возможно инъекционное введение хитозана в составе лекарственных и вакцинных препаратов [21].

В доступной литературе есть информация по исследованию хитозана в качестве сорбента антигена и стимулятора поствакцинального иммунного ответа [3][7][8][9][10][12][13][14][17][18][19][20][22]. Прогресс в изучении свойств производных хитозана позволяет предположить, что именно они могут соответствовать основным требованиям, выдвигаемым к современным адъювантам.

Предварительно для подбора оптимальных концентраций препаратов на основе хитозана для введения животным нами были проведены исследования по определению степени цитотоксичности различных разведений испытуемых образцов на перевиваемой культуре клеток почки теленка ПТ-80 [6][11].

Цель данного исследования – изучить адъювантные свойства производных хитозана в различных концентрациях при введении мышам антирабической вакцины.

Хитозан. В качестве исходных были взяты следующие препараты хитозана производства ООО «Биопрогресс» (г. Щелково, Россия), приготовленные на основе физиологического раствора (NaCl 0,9%-й):

Вакцины против бешенства животных:

Схема опыта с животными. Для проведения исследования было сформировано 37 однородных групп самок белых лабораторных мышей массой 21–35 г, возрастом 85–100 сут по 6 гол. в каждой, которым вводили исследуемые препараты в объеме 0,3 см³ по схеме, указанной в таблице.

Перед экспериментом все лабораторные животные в течение 14 дней прошли карантинирование. Ежедневно проводили клинический осмотр и контрольное взвешивание подопытных мышей. Через 28 дней с момента введения препаратов животных декапитировали и отбирали патологический материал (органы и сыворотка крови) для дальнейших исследований.

Все эксперименты на животных проводились в строгом соответствии с межгосударственными стандартами по содержанию и уходу за лабораторными животными ГОСТ 33216-2014 и ГОСТ 33215-2014, принятыми Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации, а также согласно требованиям Директивы 2010/63/EU Европейского парламента и Совета Европейского союза от 22.09.2010 по охране животных, используемых в научных целях.

Индекс массы органов определяли как отношение массы органа к массе тела животного (индекс массы органа = mоргана / mживотного).

Определение титра антирабических антител. С целью выявления адъювантных свойств препаратов хитозана определяли уровень антирабических антител в сыворотке крови лабораторных животных в реакции диффузионной преципитации согласно инструкции к «Набору компонентов для диагностики бешенства животных в реакции диффузионной преципитации (РДП)» производства ФГБНУ «Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности» (Россия).

Статистическая обработка. Статистическую обработку полученных данных производили с использованием принятой в биологии и медицине стандартной программы Microsoft Excel 2007. Результаты считали достоверными при уровне вероятности р ≤ 0,05.

Результаты предварительных испытаний на культуре клеток ПТ-80 показали, что хитозан пищевой (кислоторастворимый) в разведении 1:4 обладает цитотоксическим действием [6], поэтому в эксперименте на лабораторных животных использовали разведения 1:64 и 1:10⁸.

В течение всего времени наблюдения за мышами отклонений в поведении животных не наблюдали, специфическая смерть отсутствовала. При вскрытии мышей патологических изменений в местах инъекций (наличие воспаления, грануляции и др.) и во внутренних органах отмечено не было [6].

Печень – это орган, реагирующий увеличением размеров при острой токсичности, уменьшением – при хронической токсичности. Поэтому производили расчет индекса массы органа.

Как показано на рисунке 1, у мышей всех групп значения средних индексов массы печени находились в диапазоне от 0,045 до 0,050. Это говорит о том, что исследуемые препараты не обладают острой токсичностью.

Селезенка является крупнейшим лимфоидным органом. Поэтому для оценки реакции иммунной системы на введение исследуемых препаратов рассчитывали индексы массы данного органа подопытных мышей.

Средние индексы массы селезенки животных (рис. 2), определенные для групп № 1–8 и 10–16, или соответствуют значениям, полученным для групп № 19, 20 и 37, или превышают их (р ≤ 0,05). Это может свидетельствовать о стимулировании работы иммунной системы мышей препаратами хитозана. Однако для группы № 9 средний индекс массы селезенки ниже, чем в контрольных группах. Можно предположить, что хитозан пищевой (водорастворимый) в разведении 1:64 при внутримышечном введении не оказывает выраженного иммуностимулирующего действия.

Для подтверждения адъювантных свойств хитозана следующим этапом исследования было определение уровня антирабических антител в сыворотке крови лабораторных животных в реакции диффузионной преципитации. Результаты эксперимента представлены на рисунке 3.

Полученные данные свидетельствуют о том, что вакцинация лабораторных животных без применения исследуемого вещества (группы № 19 и 20) приводит к выработке антирабических антител в титре 1:32, тогда как подкожное введение хитозана водорастворимого (сукцината) во всех испытуемых концентрациях (группы № 2, 4 и 6) в сочетании с вакциной стимулирует образование антител до уровня 1:64. Хитозан пищевой (кислоторастворимый) во всех исследуемых концентрациях (группы № 13–16) и хитозан пищевой (водорастворимый) в разведении 1:10⁸ (группы № 11 и 12) способствуют выработке антител независимо от способа введения.

При внутримышечном введении хитозана водорастворимого (сукцинат) во всех исследуемых концентрациях (группы № 1, 3 и 5), хитозана пищевого (водорастворимого) при подкожном в разведении 1:4 (группа № 8) и внутримышечном в разведении 1:64 (группа № 9) введении отмечена тенденция к снижению уровня антирабических антител до 1:8 – 1:16. В связи с этим можно предположить, что данные препараты в указанных разведениях и при испытуемых способах введения угнетают иммунный ответ, так как природные соли хитозана практически нерастворимы при pH выше 6, что может быть проблематичным для доставки вакцинных антигенов, растворимых и стабильных при нейтральном pH или выше [2].

Показано, что исследуемые препараты на основе хитозана не оказывают негативного влияния на организм лабораторных животных и обладают иммуногенными свойствами.

В качестве экономически выгодного адъюванта для практического применения можно рекомендовать: хитозан водорастворимый (сукцинат) для подкожного введения; хитозан пищевой (кислоторастворимый) в концентрации 1:64 и выше, а также хитозан пищевой (водорастворимый) в концентрации 1:10⁸ для подкожного и внутримышечного введения. Как показывают результаты наших исследований и других авторов [2], хитозан водорастворимый (сукцинат) при внутримышечном введении и хитозан пищевой (водорастворимый) в концентрациях 1:4 при подкожном и 1:64 при внутримышечном введении снижают эффективность вакцины.