Чупин Сергей Александрович - канд. биол. наук, ведущий научный сотрудник референтной лаборатории по бешенству и BSE, ФГБУ «ВНИИЗЖ».
л. Гвардейская, 6, мкр. Юрьевец, Владимир, 600901
Sergei A. Chupin - Cand. Sci. (Biology), Leading Researcher, Reference Laboratory for Rabies and BSE, Federal Centre for Animal Health.
6 Gvardeyskaya str., Yur’evets, Vladimir 600901
Введение. На достоверность результатов, получаемых при проведении ПЦР-диагностики, могут влиять такие факторы, как ошибки оператора, неполадки в работе амплификатора, наличие в образце ингибиторов реакции, низкое качество реактивов и другое. Все это может приводить к появлению так называемых ложноотрицательных результатов.
Цель исследования. Разработка системы внутреннего контроля на основе гетерологичного вируса ньюкаслской болезни при детекции вируса бешенства методом полимеразной цепной реакции.
Материалы и методы. В качестве внутреннего контрольного образца использовалась «Вакцина против ньюкаслской болезни из штамма «Ла-Сота» сухая живая» производства ФГБУ «ВНИИЗЖ» (Россия). РНК из образцов выделяли с помощью набора реагентов «РИБО-сорб» (ФБУН «Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии» Роспотребнадзора, Россия). Для полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией использовали реактивы фирмы Promega (США) и олигонуклеотиды производства ООО «Синтол» (Россия).
Результаты. В качестве объекта для внутреннего контрольного образца выбран штамм «Ла-Сота» вируса ньюкаслской болезни. Проведен дизайн праймеров. В серии экспериментов установлено, что ПЦР-система для внутреннего контрольного образца не конкурирует с ПЦР-системой для вируса бешенства при их совместном использовании. Оптимизированы основные параметры обратной транскрипции и полимеразной реакции. Проведена валидация разработанной методики, в ходе которой определялись такие характеристики, как правильность, специфичность, чувствительность, промежуточная прецизионность в условиях повторяемости (сходимость) и промежуточная прецизионность в условиях воспроизводимости (воспроизводимость). По результатам валидации полученные характеристики метода соответствуют требуемым.
Заключение. На основе штамма «Ла-Сота» вируса ньюкаслской болезни разработана система внутреннего контрольного образца для использования совместно с методикой выявления вируса бешенства методом полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией, позволяющая контролировать ход всех этапов анализа в каждой реакционной пробирке. Данная система при надлежащей оптимизации потенциально может применяться также в экспериментальных научных исследованиях в соответствующих профильных научных организациях при ПЦР-диагностике заболеваний, вызываемых другими РНК-содержащими вирусами.
Introduction. The following factors can impact the reliability of polymerase chain reaction diagnosis: operator errors, amplifier malfunction, presence of reaction inhibitors in the sample, poor reagent quality and others. All this can lead to the so-called false negative results.
Objective. Construction of the internal control based on heterologous Newcastle disease virus for detection of rabies virus by polymerase chain reaction.
Materials and methods. Dry live vaccine against Newcastle disease based on LaSota strain produced by the Federal Centre for Animal Health (Russia) was used as an internal control. RNA extraction from samples was performed with “Ribosorb” reagent kit (Central Research Institute for Epidemiology of the Rospotrebnadzor, Russia). Promega Corporation reagents (USA) and oligonucleotides manufactured by the Syntol Company (Russia) were used for the reverse transcription polymerase chain reaction.
Results. LaSota strain of Newcastle disease virus was selected as the target for the internal control. The primers were designed. Experiments showed that the PCR system for the internal control did not compete with the PCR system for the rabies virus when they were used together.The main parameters of reverse transcription and polymerase reaction were optimized. The developed method was validated using several key parameters: correctness, specificity, sensitivity, repeatability (intermediate precision under same conditions), and reproducibility (intermediate precision under different conditions). Validation results have shown that the method characteristics comply with the required ones.
Conclusion. Newcastle disease virus LaSota strain-based internal control has been constructed for use together with reverse transcription polymerase chain reaction assay for rabies virus detection that allows control of the assay stages in each reaction tube. This internal control after its proper optimization can be also used in experimental studies carried out at relevant research institutions for PCR diagnosis of the diseases caused by other RNA-containing viruses.
The authors declare that there are no conflicts of interest present.