Яковлева Анастасия Сергеевна, канд. биол. наук, старший научный сотрудник референтной лаборатории по особо опасным болезням
мкр. Юрьевец, г. Владимир, 600901
Anastasia S. Yakovleva, Cand. Sci. (Biology), Senior Researcher, Reference Laboratory for Highly Dangerous Diseases
Yur’evets, Vladimir 600901
Каньшина Анжелика Владимировна, канд. вет. наук, старший научный сотрудник референтной лаборатории по особо опасным болезням
мкр. Юрьевец, г. Владимир, 600901
Anzhelika V. Kanshina, Cand. Sci. (Veterinary Medicine), Senior Researcher, Reference Laboratory for Highly Dangerous Diseases
Yur’evets, Vladimir 600901
Тимина Анна Михайловна, канд. вет. наук, старший научный сотрудник референтной лаборатории по особо опасным болезням
мкр. Юрьевец, г. Владимир, 600901
Anna M. Timina, Cand. Sci. (Veterinary Medicine), Senior Researcher, Reference Laboratory for Highly Dangerous Diseases
Yur’evets, Vladimir 600901
Введение. Возбудитель новой коронавирусной инфекции (COVID-19) SARS-CoV-2 получил широкое распространение в мире, став причиной пандемии, которая началась в 2019 г. Вирус является зооантропонозным инфекционным агентом, вызывает инфекцию как у человека, так и у многих видов млекопитающих. К настоящему времени имеются сообщения о выявлении SARS-CoV-2 у домашних животных, а также у представителей дикой фауны. Кроме того, проведены исследования по успешному экспериментальному заражению некоторых видов животных. Имеются также доказательства того, что инфицированные особи могут передавать вирус другим животным в естественных условиях при контакте, в том числе между разными видами. В настоящее время ряд исследователей опасается, что SARS-CoV-2 распространится на виды млекопитающих в дикой природе, которые станут природным резервуаром, что может быть причиной вспышек инфекции в популяции людей. При этом воздействие вируса на потенциально восприимчивые виды животных дикой природы, в том числе исчезающие, в настоящее время до конца не изучено. В связи с этим необходимо проводить исследования по изучению распространения данной инфекции среди животных дикой фауны. Для этого требуются высокочувствительные и специфичные диагностические методы. Иммуноферментный анализ с применением в качестве антигена нуклеокапсидного белка SARS-CoV-2 может быть использован для серологического надзора за новой коронавирусной инфекцией среди животных. Применение в качестве антигена рекомбинантного белка является наиболее предпочтительным с точки зрения безопасности.
Цель исследования. Получение рекомбинантного нуклеокапсидного белка SARS-CoV-2 в высокой концентрации и проверка его антигенной активности и специфичности.
Материалы и методы. В работе использовали: SARS-CoV-2, плазмиду pQE, штамм Escherichia coli JM109; осуществляли обратную транскрипцию и полимеразную цепную реакцию, молекулярное клонирование, синтез рекомбинантного белка, очистку рекомбинантного белка, применяли непрямой вариант иммуноферментного анализа.
Результаты. Выполнено молекулярное клонирование N-гена SARS-CoV-2 с использованием прокариотической системы экспрессии. Получены клоны Escherichia coli, продуцирующие рекомбинантный нуклеокапсидный белок SARS-CoV-2 размером 33 кДа. Определены оптимальные условия экспрессии и очистки, обеспечивающие получение препарата антигена в высокой концентрации. Показано, что оптимальной концентрацией индуктора является 0,5 мМ, оптимальный период экспрессии – 4 ч. В результате исследования оптимальных условий очистки рекомбинантного антигена в качестве денатурирующего агента определена мочевина в концентрации 8 М, подобрана оптимальная концентрация имидазола – 0,4 М в элюирующем буфере. Использование оптимальной схемы экспрессии и очистки позволило получить 1,5 мг очищенного антигена с 100 мл культуры Escherichia coli. Показана высокая антигенная активность и специфичность рекомбинантного белка в непрямом варианте иммуноферментного анализа.
Заключение. Получение рекомбинантного нуклеокапсидного белка SARS-CoV-2 в высокой концентрации позволит в перспективе использовать его в качестве антигена при разработке иммуноферментной тест-системы для выявления антител к нуклеокапсидному белку SARS-CoV-2 в сыворотках крови животных.
Introduction. The new coronavirus infection (COVID-19) agent SARS-CoV-2 has become widespread in the world and has caused the pandemic that started in 2019. The virus is a zooanthroponotic infectious agent that causes infection in humans as well as in many mammal species. To date, SARS-CoV-2 has been reported both in domestic and in wild animals. Moreover, successful experimental infection of certain animal species was reported during the studies. There is also the evidence that infected animals can transmit the virus to other animals in natural settings through contactincluding virus transmission between animals of different species. Currently, some researchers fear that SARS-CoV-2 may spread to mammalian species in the wild that will become a natural reservoir responsible for this infection outbreaks in humans. Furthermore, the virus effect on potentially susceptible wild animal species, including endangered animal species, is currently not fully understood. Therefore, the infection spread in wild animals requires further study. This requires highly sensitive and specific diagnostic methods. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) using SARS-CoV-2 nucleocapsid protein as an antigen can be used for serological surveillance of the new coronavirus infection in animals. Recombinant protein used as an antigen is the most preferable because of its safety.
Objective. The study was aimed at preparing highly concentrated recombinant SARS-CoV-2 nucleocapsid protein and testing it for antigenic activity and specificity.
Materials and methods. The following was used for the study: SARS-CoV-2, pQE plasmid, Escherichia coli JM109 strain. The following was performed: reverse transcription and polymerase chain reaction, molecular cloning, recombinant protein synthesis, recombinant protein purification, indirect ELISA was used.
Results. Molecular cloning of SARS-CoV-2 N-gene was carried out using prokaryotic expression system. Escherichia coli clones producing 33 kDa recombinant SARSCoV-2 nucleocapsid protein were prepared. Optimal expression and purification conditions for highly concentrated antigen preparation were determined. It was shown that optimal inducer concentration was 0.5 mМ, optimal expression period was 4 hours. Urea at a concentration of 8 M as a denaturing agent and optimal imidazole concentration of 0.4 M in the elution buffer were selected based on the results of study of optimal conditions for recombinant antigen purification. Use of the optimal expression and purification procedure allowed us to prepare 1.5 mg of purified antigen from 100 mL of Escherichia coli culture. The recombinant protein demonstrated its high antigenic activity and specificity when tested with indirect ELISA.
Conclusion. Preparation of highly concentrated recombinant SARS-CoV-2 nucleocapsid protein enables its further use as an antigen for ELISA test system for detection of antibodies against SARS-CoV-2 nucleocapsid protein in animal sera.
The authors declare that there are no conflicts of interest present.