veterinaryВетеринария сегодняVeterinary Science Today2304-196X2658-6959"Veinard"10.29326/2304-196X-2025-14-1-40-46veterinary-891Research ArticleОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ | БОЛЕЗНИ ПТИЦORIGINAL ARTICLES | AVIAN DISEASESРазработка тест-системы для выявления РНК вируса гриппа птиц подтипов H5 и H7 методом мультиплексной ОТ-ПЦР в режиме реального времени с использованием внутреннего контрольного образцаDevelopment of test-system for detection of H5 and H7 avian influenza virus RNA by multiplex real-time RT-PCR assay using internal controlhttps://orcid.org/0009-0001-6119-0202ГрехневаА. Д.GrekhnevaA. D.

Грехнева Алена Дмитриевна, аспирант, ведущий специалист референтной лаборатории вирусных болезней птиц

мкр. Юрьевец, г. Владимир, 600901

Alena D. Grekhneva, Postgraduate Student, Leading Specialist, Reference Laboratory for Avian Viral Diseases

Yur’evets, Vladimir 600901

grehneva@arriah.ruhttps://orcid.org/0000-0002-3015-5594ЗиняковН. Г.ZinyakovN. G

Зиняков Николай Геннадьевич, канд. биол. наук, ведущий научный сотрудник референтной лаборатории вирусных болезней птиц

мкр. Юрьевец, г. Владимир, 600901

Nikolay G. Zinyakov, Cand. Sci. (Biology), Leading Researcher, Reference Laboratory for Avian Viral Diseases

Yur’evets, Vladimir 600901

zinyakov@arriah.ruhttps://orcid.org/0000-0001-6314-2119АндриясовА. В.AndriyasovA. V.

Андриясов Артем Валерьевич, канд. биол. наук, ведущий научный сотрудник референтной лаборатории вирусных болезней птиц

мкр. Юрьевец, г. Владимир, 600901

Artem V. Andriyasov, Cand. Sci. (Biology), Leading Researcher, Reference Laboratory for Avian Viral Diseases

Yur’evets, Vladimir 600901

andriyasov_av@arriah.ruhttps://orcid.org/0000-0002-1466-7602КозловА. А.KozlovA. A.

Козлов Антон Александрович, канд. биол. наук, научный сотрудник референтной лаборатории вирусных болезней птиц 

мкр. Юрьевец, г. Владимир, 600901

Anton  A.  Kozlov, Cand. Sci. (Biology), Researcher, Reference Laboratory for Avian Viral Diseases

Yur’evets, Vladimir 600901

kozlov_aa@arriah.ruhttps://orcid.org/0000-0001-5501-4432ОвчинниковаЕ. В.OvchinnikovaE. V.

Овчинникова Евгения Валерьевна, канд. биол. наук, старший научный сотрудник референтной лаборатории вирусных болезней птиц

мкр. Юрьевец, г. Владимир, 600901

Evgenia V. Ovchinnikova, Cand. Sci. (Biology), Senior Researcher, Reference Laboratory for Avian Viral Diseases

Yur’evets, Vladimir 600901

ovchinnikova@arriah.ruhttps://orcid.org/0000-0002-1681-5795АндрейчукД. Б.AndreychukD. B.

Андрейчук Дмитрий Борисович, канд. биол. наук, заведующий референтной лабораторией вирусных болезней птиц

мкр. Юрьевец, г. Владимир, 600901

Dmitry B. Andreychuk, Cand. Sci. (Biology), Head of Reference Laboratory for Avian Viral Diseases

Yur’evets, Vladimir 600901

andreychuk@arriah.ruhttps://orcid.org/0000-0001-8204-280XЖестковП. Д.ZhestkovP. D.

Жестков Павел Дмитриевич, ведущий специалист референтной лаборатории вирусных болезней птиц

мкр. Юрьевец, г. Владимир, 600901

Pavel D. Zhestkov, Leading Specialist, Reference Laboratory for Avian Viral Diseases

Yur’evets, Vladimir 600901

zhestkov@arriah.ruhttps://orcid.org/0000-0002-1659-3256ЧвалаИ. А.ChvalaI. A.

Чвала Илья Александрович, канд. вет. наук, заместитель директора по НИР

мкр. Юрьевец, г. Владимир, 600901

Ilya A. Chvala, Cand. Sci. (Veterinary Medicine), Deputy Director for Research

Yur’evets, Vladimir 600901

chvala@arriah.ruФГБУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» (ФГБУ «ВНИИЗЖ»)РоссияFederal Centre for Animal HealthRussian Federation2025210320251414046Copyright © Грехнева А.Д., Зиняков Н.Г., Андриясов А.В., Козлов А.А., Овчинникова Е.В., Андрейчук Д.Б., Жестков П.Д., Чвала И.А., 20252025Грехнева А.Д., Зиняков Н.Г., Андриясов А.В., Козлов А.А., Овчинникова Е.В., Андрейчук Д.Б., Жестков П.Д., Чвала И.А.Grekhneva A.D., Zinyakov N.G., Andriyasov A.V., Kozlov A.A., Ovchinnikova E.V., Andreychuk D.B., Zhestkov P.D., Chvala I.A.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://veterinary.arriah.ru/jour/article/view/891Введение

Введение. Высокопатогенный грипп птиц является особо опасной высококонтагиозной вирусной инфекцией домашних и диких птиц, в последние годы получившей широкое распространение на территории стран Европы, Азии, Африки и Америки. Возбудитель заболевания – вирус гриппа типа А подтипов H5 и H7. Одним из наиболее быстрых и эффективных способов идентификации и типирования вируса гриппа птиц является ОТ-ПЦР в режиме реального времени, в связи с чем представляется актуальной разработка тест-системы на основе данного метода с использованием внутреннего контрольного образца для возможности контроля основных этапов проведения реакции. При этом постановка реакции в мультиплексном формате позволяет одновременно идентифицировать несколько целевых мишеней, что уменьшает расход реагентов и время постановки реакции.

Цель исследования

Цель исследования. Разработка тест-системы для выявления в пробах биологического материала РНК вируса гриппа птиц подтипов H5 и H7 методом мультиплексной ОТ-ПЦР в режиме реального времени и определение ее основных характеристик.

Материалы и методы

Материалы и методы. Использовали изоляты вируса гриппа птиц подтипов H5, H7, H3, H4, H10, H16, вирусы ньюкаслской болезни, инфекционной бурсальной болезни, инфекционного бронхита кур, болезни Марека и аденовирус птиц. В качестве внутреннего контрольного образца служил бактериофаг MS2.

Результаты

Результаты. Подобраны оптимальные сочетания систем праймеров и зондов, определены характеристики тест-системы: специфичность в отношении гомологичных и гетерологичных вирусов болезней птиц, аналитическая чувствительность, эффективность реакции амплификации, повторяемость и воспроизводимость.

Заключение

Заключение. При определении валидационных характеристик разработанной тест-системы установлена ее специфичность в отношении только вируса гриппа птиц подтипов H5 и H7, аналитическая чувствительность для каждого подтипа составила 1,5 lg ЭИД50/см3 , эффективность амплификации – 92 и 97% соответственно. Проведена апробация тест-системы при исследовании поступающих в лабораторию проб биологического материала, результаты соответствовали таковым для стандартных диагностических методов, используемых в референтной лаборатории вирусных болезней птиц ФГБУ «ВНИИЗЖ».

Introduction

Introduction. High pathogenicity avian influenza is a dangerous highly contagious viral infection of domestic and wild birds that recently has become widespread in Europe, Asia, Africa and Americas. The causative agent of the disease is type A influenza virus of subtypes H5 and H7. Real-time RT-PCR is one of the most rapid and effective techniques for avian influenza virus identification and typing, so development of the test system based on this technique with internal control to be used for control of the reaction main stages is of current importance. At the same time, the multiplex format of RT-PCR allows for simultaneous identification of several targets that reduces the consumption of reagents and the reaction time.

Objective

Objective. Development of test-system for detection of H5 and H7 avian influenza virus RNA with multiplex real-time RT-PCR in biological samples and its characterization.

Materials and methods

Materials and methods. H5, H7, H3, H4, H10, H16 avian influenza virus, Newcastle disease virus, infectious bursal disease virus, infectious bronchitis virus, Marek’s disease virus, avian adenovirus isolates were used. MS2 bacteriophage was used as internal control.

Results

Results. Optimal primer-probe combinations were selected, test-system characteristics were determined: specificity for homologous and heterologous avian disease viruses, analytical sensitivity, reaction amplification efficiency, repeatability and reproducibility.

Conclusion

Conclusion. Determination of the developed test system validation parameters has shown that it is specific only for H5 and H7 avian influenza virus, its analytical sensitivity for each subtype was 1.5 lg EID50/cm3 , and the amplification efficiency was 92 and 97%, respectively. The test system was validated through its use for testing biological samples submitted to the laboratory, the test results were consistent with the results of tests with standard diagnostic methods used in the Reference Laboratory for Avian Viral Diseases of the Federal Centre for Animal Health.

высокопатогенный грипп птицвирус гриппа птиц подтипа H5вирус гриппа птиц подтипа H7ОТ-ПЦР-РВтест-системаhigh pathogenicity avian influenzaH5 avian influenza virusH7 avian influenza virusreal-time RT-PCR test-systemРабота выполнена за счет средств ФГБУ «ВНИИЗЖ» в рамках тематики научно-исследовательских работ «Ветеринарное благополучие».The study was funded by the Federal Centre for Animal Health within the research topic “Veterinary Welfare”.ReferencesLycett S. J., Duchatel F., Digard P. A brief history of bird flu. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 2019; 374 (1775):20180257. https://doi.org/10.1098/rstb.2018.0257Lycett S. J., Duchatel F., Digard P. A brief history of bird flu. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 2019; 374 (1775):20180257. https://doi.org/10.1098/rstb.2018.0257Alexander D. J. A review of avian influenza in different bird species. Veterinary Microbiology. 2000; 74 (1–2): 3–13. https://doi.org/10.1016/s0378-1135(00)00160-7Alexander D. J. A review of avian influenza in different bird species. Veterinary Microbiology. 2000; 74 (1–2): 3–13. https://doi.org/10.1016/s0378-1135(00)00160-7OlsenB., MunsterV. J., WallenstenA., WaldenströmJ., OsterhausA. D. M. E., Fouchier R. A. M. Global patterns of influenza A virus in wild birds. Science. 2006; 312 (5772): 384–388. https://doi.org/10.1126/science.1122438Olsen B., Munster V. J., Wallensten A., Waldenström J., OsterhausA. D. M. E., FouchierR. A. M. GlobalpatternsofinfluenzaAvirusinwildbirds. Science. 2006; 312 (5772): 384–388. https://doi.org/10.1126/science.1122438Webster R. G., Bean W. J., Gorman O. T., Chambers T. M., Kawaoka Y. Evolution and ecology of influenza A viruses. Microbiological Reviews. 1992; 56 (1): 152–179. https://doi.org/10.1128/mr.56.1.152-179.1992Webster R. G., Bean W. J., Gorman O. T., Chambers T. M., Kawaoka Y. Evolution and ecology of influenza A viruses. Microbiological Reviews. 1992; 56 (1): 152–179. https://doi.org/10.1128/mr.56.1.152-179.1992Kida Y., Okuya K., Saito T., Yamagishi J., Ohnuma A., Hattori T., et al. Structural requirements in the hemagglutinin cleavage site-coding RNA region for the generation of highly pathogenic avian influenza virus. Pathogens. 2021; 10 (12):1597. https://doi.org/10.3390/pathogens10121597Kida Y., Okuya K., Saito T., Yamagishi J., Ohnuma A., Hattori T., et al. Structural requirements in the hemagglutinin cleavage site-coding RNA region for the generation of highly pathogenic avian influenza virus. Pathogens. 2021; 10 (12):1597. https://doi.org/10.3390/pathogens10121597Spackman E. A brief introduction to avian influenza virus. Methodsin Molecular Biology. 2020; 2123: 83–92. https://doi.org/10.1007/978-1-0716-0346-8_7Spackman E. A Brief introduction to avian influenza virus. Methodsin Molecular Biology. 2020; 2123: 83–92. https://doi.org/10.1007/978-1-0716-0346-8_7Pasick J., Handel K., Robinson J., Copps J., Ridd D., Hills K., et al. Intersegmental recombination between the haemagglutinin and matrix genes was responsible for the emergence of a highly pathogenic H7N3 avian influenza virus in British Columbia. Journal of General Virology. 2005; 86 (3): 727–731. https://doi.org/10.1099/vir.0.80478-0Pasick J., Handel K., Robinson J., Copps J., Ridd D., Hills K., et al. Intersegmental recombination between the haemagglutinin and matrix genes was responsible for the emergence of a highly pathogenic H7N3 avian influenza virus in British Columbia. Journal of General Virology. 2005; 86 (3): 727–731. https://doi.org/10.1099/vir.0.80478-0Suarez D. L., Senne D. A., Banks J., Brown I. H., Essen S. C., Lee C., et al. Recombination resulting in virulence shift in avian influenza outbreak, Chile. Emerging Infectious Diseases. 2004; 10 (4): 693–699. https://doi.org/10.3201/eid1004.030396Suarez D. L., Senne D. A., Banks J., Brown I. H., Essen S. C., Lee C., et al. Recombination resulting in virulence shift in avian influenza outbreak, Chile. Emerging Infectious Diseases. 2004; 10 (4): 693–699. https://doi.org/10.3201/eid1004.030396Ирза В. Н., Волков М. С., Варкентин А. В. О текущей панзоотии высокопатогенного гриппа птиц. Эффективное животноводство. 2022; (5): 85–86. https://elibrary.ru/rcsitlIrza V. N., Volkov M. S., Varkentin A. V. O tekushchei panzootii vysokopatogennogo grippa ptits = About ongoing high pathogenicity avian influenza panzootic. Effectivnoe zhivotnovodstvo. 2022; (5): 85–86. https://elibrary.ru/rcsitl (in Russ.)Liu W. J., Xiao H., Dai L., Liu D., Chen J., Qi X., et al. Avian influenza A (H7N9) virus: from low pathogenic to highly pathogenic. Frontiers of Medicine. 2021; 15 (4): 507–527. https://doi.org/10.1007/s11684-020-0814-5Liu W. J., Xiao H., Dai L., Liu D., Chen J., Qi X., et al. Avian influenza A (H7N9) virus: from low pathogenic to highly pathogenic. Frontiers of Medicine. 2021; 15 (4): 507–527. https://doi.org/10.1007/s11684-020-0814-5World Organisation for Animal Health. WAHIS. Disease situation. https://wahis.woah.org/#/dashboards/country-or-disease-dashboardWorld Organisation for Animal Health. WAHIS. Disease situation. https://wahis.woah.org/#/dashboards/country-or-disease-dashboardSuttonT. C. The pandemic threat of emerging H5 and H7 avian influenza viruses. Viruses. 2018; 10 (9):461. https://doi.org/10.3390/v10090461SuttonT. C. The pandemic threat of emerging H5 and H7 avian influenza viruses. Viruses. 2018; 10 (9):461. https://doi.org/10.3390/v10090461O’Connell K. P., BucherJ. R., AndersonP. E., CaoC. J., KhanA. S., Gostomski M. V., Valdes J. J. Real-time fluorogenic reverse transcription-PCR assays for detection of bacteriophage MS2. Applied and Environmental Microbiology. 2006; 72 (1): 478–483. https://doi.org/10.1128/AEM.72.1.478-483.2006O’Connell K. P., BucherJ. R., AndersonP. E., CaoC. J., KhanA. S., Gostomski M. V., Valdes J. J. Real-time fluorogenic reverse transcription-PCR assays for detection of bacteriophage MS2. Applied and Environmental Microbiology. 2006; 72 (1): 478–483. https://doi.org/10.1128/AEM.72.1.478-483.2006Kalthoff D., Bogs J., Harder T., Grund C., Pohlmann A., Beer M., Hoffmann B. Nucleic acid-based detection of influenza A virussubtypes H7 and N9 with a special emphasis on the avian H7N9 virus. Eurosurveillance. 2014; 19 (10):20731. https://doi.org/10.2807/1560-7917.es2014.19.10.20731Kalthoff D., Bogs J., Harder T., Grund C., Pohlmann A., Beer M., Hoffmann B. Nucleic acid-based detection of influenza A virussubtypes H7 and N9 with a special emphasis on the avian H7N9 virus. Eurosurveillance. 2014; 19 (10):20731. https://doi.org/10.2807/1560-7917.es2014.19.10.20731Liu J., Yao L., Zhai F., Chen Y., Lei J., Bi Z., et al. Development and application of a triplex real-time PCR assay for the simultaneous detection of avian influenza virussubtype H5, H7 and H9. Journal of VirologicalMethods. 2018; 252: 49–56. https://doi.org/10.1016/j.jviromet.2017.11.005Liu J., Yao L., Zhai F., Chen Y., Lei J., Bi Z., et al. Development and application of a triplex real-time PCR assay for the simultaneous detection of avian influenza virussubtype H5, H7 and H9. Journal of VirologicalMethods. 2018; 252: 49–56. https://doi.org/10.1016/j.jviromet.2017.11.005LiuL., FangB., YuX., LiX., LeiY. K., ChenD. StrengthenedmonitoringofH5 avian influenza virusesin external environment in Hubei, 2018. Current MedicalScience. 2020; 40 (1): 63–68. https://doi.org/10.1007/s11596-020-2147-7Liu L., Fang B., Yu X., Li X., Lei Y. K., Chen D. Strengthened monitoring of H5 avian influenza viruses in external environment in Hubei, 2018. Current MedicalScience. 2020; 40 (1): 63–68. https://doi.org/10.1007/s11596-020-2147-7Spackman E., Senne D. A., Myer T. J., Bulaga L. L., Garber L. P., Perdue M. L., et al. Development of a real-time reverse transcriptase PCR assay for type A influenza virus and the avian H5 and H7 hemagglutinin subtypes. Journal of Clinical Microbiology. 2002; 40 (9): 3256–3260. https://doi.org/10.1128/jcm.40.9.3256-3260.2002Spackman E., Senne D. A., Myer T. J., Bulaga L. L., Garber L. P., Perdue M. L., et al. Development of a real-time reverse transcriptase PCR assay for type A influenza virus and the avian H5 and H7 hemagglutinin subtypes. Journal of Clinical Microbiology. 2002; 40 (9): 3256–3260. https://doi.org/10.1128/jcm.40.9.3256-3260.2002Bustin S. A., Benes V., Garson J. A., Hellemans J., Huggett J., Kubista M., et al. The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clinical Chemistry. 2009; 55 (4): 611–622. https://doi:10.1373/clinchem.2008.112797Bustin S. A., Benes V., Garson J. A., Hellemans J., Huggett J., Kubista M., et al. The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clinical Chemistry. 2009; 55 (4): 611–622. https://doi:10.1373/clinchem.2008.112797Ребриков Д. В., Саматов Г. А., Трофимов Д. Ю., Семенов П. А. ПЦР в реальном времени: учебное пособие. М.: БИНОМ. Лаборатория знаний; 2011. 225 с. https://elibrary.ru/raymplRebrikov D. V., Samatov G. A., Trofimov D. Yu., Semenov P. A. Realtime PCR: study guide. Moscow: BINOM. Laboratoriya znanii; 2011. 225 p. https://elibrary.ru/raympl (in Russ.)Green M. R., Sambrook J. Constructing a standard curve forreal-time polymerase chain reaction (PCR) experiments. Cold SpringHarbor Protocols. 2018; 2018 (10). https://doi.org/10.1101/pdb.prot095026Green M. R., Sambrook J. Constructing a standard curve forreal-time polymerase chain reaction (PCR) experiments. Cold SpringHarbor Protocols. 2018; 2018 (10). https://doi.org/10.1101/pdb.prot095026Доронин М. И., Михалишин Д. В., Спрыгин А. В., Мазлум А., Жбанова Т. В., Груздев К. Н., Чернышова Е. В. Современные подходы к разработке тест-систем на основе количественной ПЦР в режиме реального времени. Ветеринария сегодня. 2023; 12 (3): 197–207. https://doi.org/10.29326/2304-196X-2023-12-3-197-207Doronin М. I., Mikhalishin D. V., Sprygin А. V., Mazloum А., Zhbanova Т. V., Gruzdev К. N., Chernyshova Е. V. Current approaches to development of real-time qPCR test-kits. Veterinary Science Today. 2023; 12 (3): 197–207. https://doi.org/10.29326/2304-196X-2023-12-3-197-207Green M. R., Sambrook J. Analysis and normalization of real-time polymerase chain reaction (PCR) experimental data. Cold Spring Harbor Protocols. 2018; 2018 (10). https://doi.org/10.1101/pdb.top095000Green M. R., Sambrook J. Analysis and normalization of real-time polymerase chain reaction (PCR) experimental data. Cold Spring Harbor Protocols. 2018; 2018(10). https://doi.org/10.1101/pdb.top095000Андрейчук Д. Б., Андриясов А. В., Чвала И. А. Методические рекомендации по выявлению РНК вируса гриппа птиц подтипов Н5 и Н7 методом ОТ-ПЦР в режиме реального времени: № 46-16. Владимир: ФГБУ «ВНИИЗЖ»; 2016. 12 с.AndreychukD. B., AndriyasovA. V., Chvala I. A. Methodical guidelines for detection of H5 and H7 avian influenza virus RNA with real-time RT-PCR: No. 46-16. Vladimir: Federal Centre for Animal Health; 2016. 12 p. (in Russ.)

The authors declare that there are no conflicts of interest present.