veterinaryВетеринария сегодняVeterinary Science Today2304-196X2658-6959"Veinard"10.29326/2304-196X-2024-13-3-223-233veterinary-843Research ArticleОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ | БОЛЕЗНИ СВИНЕЙORIGINAL ARTICLES | PORCINE DISEASESРазработка и валидация высокочувствительного метода мультиплексной ОТ-ПЦР-РВ для обнаружения генома вируса классической чумы свинейDevelopment and validation of highly sensitive multiplex real-time RT-PCR assay for detection of classical swine fever virus genomehttps://orcid.org/0009-0001-0801-2394СадчиковаА. С.SadchikovaA. S.

Садчикова Анастасия Сергеевна - аспирант, ветеринарный врач референтной лаборатории по африканской чуме свиней мкр. Юрьевец, г. Владимир, 600901

Anastasiya S. Sadchikova - Postgraduate Student, Veterinarian, Reference Laboratory for African Swine Fever

Yur’evets, Vladimir 600901

sadchikova@arriah.ruhttps://orcid.org/0000-0002-5438-8026ИголкинА. С.IgolkinA. S.

Иголкин Алексей Сергеевич -  канд. вет. наук, заведующий референтной лабораторией по африканской чуме свиней 

мкр. Юрьевец, г. Владимир, 600901

Alexey  S.  Igolkin - Cand. Sci. (Veterinary Medicine), Head of Reference Laboratory for African Swine Fever

Yur’evets, Vladimir 600901

igolkin_as@arriah.ruhttps://orcid.org/0000-0003-3604-7161ЧернышевР. С.ChernyshevR. S.

Чернышев Роман Сергеевич - аспирант, ветеринарный врач референтной лаборатории по  африканской чуме свиней 

мкр. Юрьевец, г. Владимир, 600901

Roman  S.  Chernyshev - Postgraduate Student, Veterinarian, Reference Laboratory for African Swine Fever

Yur’evets, Vladimir 600901

chernishev_rs@arriah.ruhttps://orcid.org/0000-0002-1466-7602КозловА. А.KozlovA. A.

Козлов Антон Александрович - канд. биол. наук, научный сотрудник референтной лаборатории вирусных болезней 

мкр. Юрьевец, г. Владимир, 600901

Anton A. Kozlov - Cand. Sci. (Biology), Researcher, Reference  Laboratory for Avian Viral Diseases

Yur’evets, Vladimir 600901

kozlov_aa@arriah.ruhttps://orcid.org/0000-0003-4692-1297КолбинИ. С.KolbinI. S.

Колбин Иван Сергеевич - ветеринарный врач референтной лаборатории по африканской чуме свиней  

мкр. Юрьевец, г. Владимир, 600901

Ivan S. Kolbin - Veterinarian, Reference Laboratory for African Swine Fever

Yur’evets, Vladimir 600901

kolbin@arriah.ruhttps://orcid.org/0000-0002-1659-3256СпрыгинА. В.SpryginA. V.

Спрыгин Александр Владимирович -д-р биол. наук, старший научный сотрудник референтной лаборатории болезней крупного рогатого скота, заведующий лабораторией молекулярных и генетических исследований 

мкр. Юрьевец, г. Владимир, 600901

Alexander  V.  Sprygin - Dr. Sci. (Biology), Senior Researcher, Reference Laboratory for Bovine Diseases, Head of  Molecular and  Genetic Research Laboratory

Yur’evets, Vladimir 600901

sprygin@arriah.ruhttps://orcid.org/0000-0002-4057-2367БирюченковД. А.BiryuchenkovD. A.

Бирюченков Дмитрий Анатольевич - канд. вет. наук, заведующий лабораторией профилактики болезней свиней 

мкр. Юрьевец, г. Владимир, 600901

 

Dmitriy А. Biryuchenkov - Cand. Sci. (Veterinary Medicine), Head of Laboratory for Porcine Prevention

Yur’evets, Vladimir 600901

biruchenkov@arriah.ruhttps://orcid.org/0000-0001-5982-3675ЧвалаИ. А.ChvalaI. A.

Чвала Илья Александрович - канд. вет. наук, заместитель директора по НИР 

мкр. Юрьевец, г. Владимир, 600901

 

Ilya A. Chvala - Cand. Sci. (Veterinary Medicine), Deputy Director for Research

Yur’evets, Vladimir 600901

chvala@arriah.ruhttps://orcid.org/0000-0002-5982-8393МазлумА.MazloumA.

Мазлум Али - канд. биол. наук

г. Батон-Руж, LA 70803

Ali Mazloum - Cand. Sci. (Biology)

Baton Rouge, LA 70803

ali.mazloum6@gmail.comФГБУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» (ФГБУ «ВНИИЗЖ»)РоссияFederal Centre for Animal HealthRussian FederationУниверситет штата ЛуизианаСоединённые Штаты АмерикиLouisiana State UniversityUnited States202416092024133223233Copyright © Садчикова А.С., Иголкин А.С., Чернышев Р.С., Козлов А.А., Колбин И.С., Спрыгин А.В., Бирюченков Д.А., Чвала И.А., Мазлум А., 20242024Садчикова А.С., Иголкин А.С., Чернышев Р.С., Козлов А.А., Колбин И.С., Спрыгин А.В., Бирюченков Д.А., Чвала И.А., Мазлум А.Sadchikova A.S., Igolkin A.S., Chernyshev R.S., Kozlov A.A., Kolbin I.S., Sprygin A.V., Biryuchenkov D.A., Chvala I.A., Mazloum A.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://veterinary.arriah.ru/jour/article/view/843

Проблема классической чумы свиней в свиноводстве по-прежнему остается актуальной во всем в мире, несмотря на принимаемые меры. Последний случай данного заболевания в Российской Федерации регистрировали в 2020 г., однако сохраняется угроза эмерджентного возникновения болезни. Для предотвращения заноса вируса классической чумы свиней и быстрой ликвидации потенциально возможных вспышек необходимо проведение комплекса противоэпизоотических мероприятий, преимущественно включающих вакцинопрофилактику и ежегодный диагностический мониторинг на основе молекулярно-генетических и серологических исследований. В связи с этим разработан метод полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией в режиме реального времени с использованием внутреннего контрольного образца. Праймеры в модификации LockedNucleic Acid (конформационно блокированных нуклеозидов), обеспечивающие более высокий уровень аффинности к ДНК-матрице и физико-химической стабильности, и FAM-меченый TaqMan-зонд были подобраны к 5’-нетранслируемой области генома. Также определены валидационные показатели: правильность, сходимость, воспроизводимость, специфичность и чувствительность. С целью сравнительного анализа чувствительности параллельно тестировались зашифрованными тест-системами № х1, х2 образцы смывов, органов и тканей, полученных от свиней, экспериментально зараженных эпизоотическим штаммом вируса классической чумы свиней (селезенка, почка, печень, кровь, лимфатические узлы, ректальные и оральные мазки), корма, контаминированного животными, и вируссодержащего материала с известными титрами. Показаны 100%-я диагностическая чувствительность и предел детекции в 0,23 lg ККИД50/см3 разработанного метода. При этом показатели тест-систем № х1 и х2 были ниже, что может приводить к ложноотрицательным результатам полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией в режиме реального времени (ОТ-ПЦР-РВ) и влиять на недостоверную постановку диагноза. Таким образом, представленный метод может использоваться при проведении широкомасштабного мониторинга классической чумы свиней в Российской Федерации.

Classical swine fever (CSF) remains a challenge for pig farming industrial lover the world despite the measures taken. The last CS  case in the Russian Federation was reported in 2020, however, the threat of the disease emerging still persists. A set of anti-epidemic measures including mainly preventive vaccination and annual diagnostic monitoring using molecular-genetic and serological methods is required for CSF virus introduction prevention and rapid eradication of potential disease out breaks. Therefore, areal-time reverse transcription-polymerase chain reaction using an internal control sample has been developed. Therefore, areal time reverse transcription-polymerase chain reaction using an internal control sample has been developed. Modified primers (locked nucleic acids containing conformationally blocked nucleosides) providing a higher affinity to the DNA matrix and physico-chemical stability and a FAM-labeled TaqMan probe were selected for 5’-untranslatedregion of the genome. The following validation parameters were defined: accuracy, repeatability, reproducibility, specificity and sensitivity. For comparative analysis of the developed as say sensitivity, swabs, samples of organs and tissues collected from pigs experimentally infected with an epizootic strain of the classical swine fever virus (spleen, kidney, liver, blood, lymph nodes, rectal and oral smears), animal-contaminated feed and virus-containing material with known virus titres were also tested in parallel with coded test systems No. x1 andx2. The developed assay was shown to have 100% diagnostic sensitivity and detection limit of 0,23 lgCCID50/cm3. Therewith, there sults of analysis of test systems No. x1, x2 based on above parameters were lower that could give rise to false positive real-time RT-PCR results and incorrect diagnosis. Thus, described assay can be used for extensive monitoring of classical swine fever in the Russian Federation

классическая чума свинейОТ-ПЦР-РВвнутренний контрольный образецдиагностическая чувствительностьаналитическая чувствительностьclassical swine feverreal-time RT-PCRinternal control samplediagnostic sensitivityanalytical sensitivityРабота выполнена за счет средств ФГБУ «ВНИИЗЖ» в рамках тематики научно-исследовательских работ «Ветеринарное благополучие». Авторы выражают глубокую благодарность заведующему лабораторией профилактики бактериальных болезней канд. вет. наук В. А. Евграфовой и ведущему биологу референтной лаборатории болезней крупного рогатого скота А. О. Кротовой за консультативную помощьThe study was funded by the FGBI “ARRIAH” as a part of research activities “Veterinary Welfare”. The authors express their gratitude to V. A. Evgrafova, Cand. Sci. (Veterinary Medicine), Head of Laboratory for Bacterial Disease Prevention, and A. O. Krotova, Leading Biologist, Reference Laboratory for Cattle Diseases, for advisory assistanceReferencesMalikY. S., Bhat S., KumarO. R. V., Yadav A. K., Sircar S., Ansari M. I., et al. Classical swine fever virus biology, clinicopathology, diagnosis, vaccines and a meta-analysis of prevalence: A review from the Indian perspective. Pathogens. 2020; 9 (6):500. https://doi.org/10.3390/pathogens9060500Malik Y. S., Bhat S., Kumar O. R. V., Yadav A. K., Sircar S., Ansari M. I., et al. Classical swine fever virus biology, clinicopathology, diagnosis, vaccines and a meta-analysis of prevalence: A review from the Indian perspective. Pathogens. 2020; 9 (6):500. https://doi.org/10.3390/pathogens9060500Stark R., Meyers G., Rümenapf T., Thiel H. J. Processing of pestivirus polyprotein: cleavage site between autoprotease and nucleocapsid protein of classical swine fever virus. Journal of Virology. 1993; 67 (12): 7088–7095. https://doi.org/10.1128/jvi.67.12.7088-7095.1993Stark R., Meyers G., Rümenapf T., Thiel H. J. Processing of pestivirus polyprotein: cleavage site between autoprotease and nucleocapsid protein of classical swine fever virus. Journal of Virology. 1993; 67 (12): 7088–7095. https://doi.org/10.1128/jvi.67.12.7088-7095.1993Blome S., Staubach C., Henke J., Carlson J., Beer M. Classical swine fever – an updated review. Viruses. 2017; 9 (4):86. https://doi.org/10.3390/v9040086Blome S., Staubach C., Henke J., Carlson J., Beer M. Classical swine fever – an updated review. Viruses. 2017; 9 (4):86. https://doi.org/10.3390/v9040086Edwards S., Fukusho A., Lefèvre P.-C., Lipowski A., Pejsak Z., Roehe P., Westergaard J. Classical swine fever: the global situation. Veterinary Microbiology. 2000; 73 (2–3): 103–119. https://doi.org/10.1016/s0378-1135(00)00138-3Edwards S., Fukusho A., Lefèvre P.-C., Lipowski A., Pejsak Z., Roehe P., Westergaard J. Classical swine fever: the global situation. Veterinary Microbiology. 2000; 73 (2–3): 103–119. https://doi.org/10.1016/s0378-1135(00)00138-3Оганесян А. С., Шевцов А. А., Щербаков А. В., Коренной Ф. И., Караулов А. К. Классическая чума свиней: ретроспективный анализ эпизоотической ситуации в Российской Федерации (2007–2021 гг.) и прогноз на 2022 г. Ветеринария сегодня. 2022; 11 (3): 229–238. https://doi.org/10.29326/2304-196X-2022-11-3-229-238Oganesyan А. S., Shevtsov А. А., Shcherbakov А. V., Korennoy F. I., Karaulov A. K. Classical swine fever: a retrospective analysis of the epizootic situation in the Russian Federation (2007–2021) and forecast for 2022. Veterinary Science Today. 2022; 11 (3): 229–238. https://doi.org/10.29326/2304-196X-2022-11-3-229-238Шевцов А. Классическая чума свиней: перспективы искоренения. Животноводство России. 2021; (10): 27–30. https://www.elibrary.ru/jfxaloShevtsov A. Classical swine fever: prospects of eradication. Animal Husbandry of Russia. 2021; (10): 27–30. https://www.elibrary.ru/jfxalo (in Russ.)Zhu H., Zhang H., Xu Y., Laššáková S., Korabečná M., Neužil P. PCR past, present and future. BioTechniques. 2020; 69 (4): 317–325. https://doi.org/10.2144/btn-2020-0057Zhu H., Zhang H., Xu Y., Laššáková S., Korabečná M., Neužil P. PCR past, present and future. BioTechniques. 2020; 69 (4): 317–325. https://doi.org/10.2144/btn-2020-0057Hirschhorn J. W., Avery A., Schandl C. A. Managing a PCR contamination event in a molecular pathology laboratory. In: Clinical Applications of Nucleic Acid Amplification. Methodsin Molecular Biology. Eds. M. B. Myers, C. A. Schandl. 2023; 2621: 15–26. https://doi.org/10.1007/978-1-0716-2950-5_2Hirschhorn J. W., Avery A., Schandl C. A. Managing a PCR contamination event in a molecular pathology laboratory. In: Clinical Applications of Nucleic Acid Amplification. Methods in Molecular Biology. Eds. M. B. Myers, C. A. Schandl. 2023; 2621: 15–26. https://doi.org/10.1007/978-1-0716-2950-5_2Canal C. W., Hotzel I., de Almeida L. L., Roehe P. M., Masuda A. Differentiation of classical swine fever virus from ruminant pestiviruses by reverse transcription and polymerase chain reaction (RT-PCR). Veterinary Microbiology. 1996; 48 (3–4): 373–379. https://doi.org/10.1016/0378-1135(95)00156-5Canal C. W., Hotzel I., de Almeida L. L., Roehe P. M., Masuda A. Differentiation of classical swine fever virus from ruminant pestiviruses by reverse transcription and polymerase chain reaction (RT-PCR). Veterinary Microbiology. 1996; 48 (3–4): 373–379. https://doi.org/10.1016/0378-1135(95)00156-5McGoldrick A., Lowings J. P., Ibata G., Sands J. J., Belak S., Paton D. J. A novel approach to the detection of classical swine fever virus by RT-PCR with a fluorogenic probe (TaqMan). Journal of Virological Methods. 1998; 72 (2): 125–135. https://doi.org/10.1016/s0166-0934(97)00208-5McGoldrick A., Lowings J. P., Ibata G., Sands J. J., Belak S., Paton D. J. A novel approach to the detection of classical swine fever virus by RT-PCR with a fluorogenic probe (TaqMan). Journal of Virological Methods. 1998; 72 (2): 125–135. https://doi.org/10.1016/s0166-0934(97)00208-5Hoffmann B., Beer M., Schelp C., Schirrmeier H., Depner K. Validation of a real-time RT-PCR assay for sensitive and specific detection of classical swine fever. Journal of Virological Methods. 2005; 130 (1–2): 36–44. https://doi.org/10.1016/j.jviromet.2005.05.030Hoffmann B., Beer M., Schelp C., Schirrmeier H., Depner K. Validation of a real-time RT-PCR assay for sensitive and specific detection of classical swine fever. Journal of Virological Methods. 2005; 130 (1–2): 36–44. https://doi.org/10.1016/j.jviromet.2005.05.030Latorra D., Arar K., Hurley J. M. Design considerations and effects of LNA in PCR primers. Molecular and Cellular Probes. 2003; 17 (5): 253–259. https://doi.org/10.1016/S0890-8508(03)00062-8Latorra D., Arar K., Hurley J. M. Design considerations and effects of LNA in PCR primers. Molecular and Cellular Probes. 2003; 17 (5): 253–259. https://doi.org/10.1016/S0890-8508(03)00062-8Monpoeho S., Coste-Burel M., Costa-Mattioli M., Besse B., Chomel J., Billaudel S., Ferre V. Application of a real-time polymerase chain reaction with internal positive control for detection and quantification of enterovirus in cerebrospinal fluid. European Journal of Clinical Microbiology and Infectious Diseases. 2002; 21 (7): 532–536. https://doi.org/10.1007/s10096-002-0766-5Monpoeho S., Coste-Burel M., Costa-Mattioli M., Besse B., Chomel J., Billaudel S., Ferre V. Application of a real-time polymerase chain reaction with internal positive control for detection and quantification of enterovirus in cerebrospinal fluid. European Journal of Clinical Microbiology and Infectious Diseases. 2002; 21 (7): 532–536. https://doi.org/10.1007/s10096-002-0766-5Гаврилова В. Л., Пузанкова О. С., Латышев О. Е., Иголкин А. С., Манин Б. Л., Жбанова Т. В., Южаков А. Г. Изучение культуральных и молекулярных свойств изолятов вируса классической чумы свиней, выделенных в 2016 году. Труды Федерального центра охраны здоровья животных. 2017; 15: 82–101. https://www.elibrary.ru/xrdrrbGavrilova V. L., Puzankova O. S., Latyshev O. Ye., Igolkin A. S., Manin B. L., Zhbanova T. V., Yuzhakov A. G. Studying cultural and molecular characteristics of classical swine fever virus isolates recovered in 2016. Proceedings of the Federal Centre for Animal Health. 2017; 15: 82–101. https://www.elibrary.ru/xrdrrb (in Russ.)Гилеп А. А., Башко Н. П., Усанов С. А., Камышников В. С. Импортозамещающие и экспортоориентированные отечественные диагностические средства. Лабораторная диагностика. Восточная Европа. 2014; (4): 28–45. https://elibrary.ru/taxtghGilep A., Bashko N., Usanov S., Kamyshnikov V. Import-substituting domestic diagnostic tools. Laboratory Diagnostics. Eastern Europe. 2014; (4): 28–45. https://elibrary.ru/taxtgh (in Russ.)Колбин И. С., Иголкин А. С., Гаврилова В. Л., Пузанкова О. С., Аронова Е. В., Елсукова А. А., Власова Н. Н. Определение репродуктивных свойств вируса классической чумы свиней вирулентных и вакцинных штаммов в первичных и перевиваемых культурах клеток. Ветеринария сегодня. 2022; 11 (2): 149–155. https://doi.org/10.29326/2304-196X-2022-11-2-149-155Kolbin I. S., Igolkin A. S., Gavrilova V. L., Puzankova O. S., Aronova Ye. V., Yelsukova А. А., Vlasova N. N. Determination of reproductive properties of virulent and vaccine classical swine fever virus strains in primary and continuous cell cultures. Veterinary Science Today. 2022; 11 (2): 149–155. https://doi.org/10.29326/2304-196X-2022-11-2-149-155Dreier J., Störmer M., Kleesiek K. Use of bacteriophage MS2 as an internal control in viral reverse transcription-PCR assays. Journal of ClinicalMicrobiology. 2005; 43 (9): 4551–4557. https://doi.org/10.1128/jcm.43.9.4551-4557.2005Dreier J., Störmer M., Kleesiek K. Use of bacteriophage MS2 as an internal control in viral reverse transcription-PCR assays. Journal of Clinical Microbiology. 2005; 43 (9): 4551–4557. https://doi.org/10.1128/jcm.43.9.4551-4557.2005O’Connell K. P., Bucher J. R., Anderson P. E., Cao C. J., Khan A. S., Gostomski M. V., ValdesJ. J. Real-time fluorogenic reverse transcription-PCR assays for detection of bacteriophage MS2. Applied and Environmental Microbiology. 2006; 72 (1): 478–483. https://doi.org/10.1128/aem.72.1.478-483.2006O’Connell K. P., Bucher J. R., Anderson P. E., Cao C. J., Khan A. S., Gostomski M. V., Valdes J. J. Real-time fluorogenic reverse transcription-PCR assays for detection of bacteriophage MS2. Applied and Environmental Microbiology. 2006; 72 (1): 478–483. https://doi.org/10.1128/aem.72.1.478-483.2006Bustin S. A., Benes V., Garson J. A., Hellemans J., Huggett J., Kubista M., et al. The MIQE guidelines: Minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clinical Chemistry. 2009; 55 (4): 611–622. https://doi.org/10.1373/clinchem.2008.112797Bustin S. A., Benes V., Garson J. A., Hellemans J., Huggett J., Kubista M., et al. The MIQE guidelines: Minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clinical Chemistry. 2009; 55 (4): 611–622. https://doi.org/10.1373/clinchem.2008.112797Buckwalter S. P., Sloan L. M., Cunningham S. A., Espy M. J., Uhl J. R., Jones M. F., et al. Inhibition controlsfor qualitative real-time PCR assays: Are they necessary for all specimen matrices? Journal of Clinical Microbiology. 2014; 52 (6): 2139–2143. https://doi.org/10.1128/jcm.03389-13Buckwalter S. P., Sloan L. M., Cunningham S. A., Espy M. J., Uhl J. R., Jones M. F., et al. Inhibition controls for qualitative real-time PCR assays: Are they necessary for all specimen matrices? Journal of Clinical Microbiology. 2014; 52 (6): 2139–2143. https://doi.org/10.1128/jcm.03389-13Zambenedetti M. R., Pavoni D. P., Dallabona A. C., Dominguez A. C., Poersch C. de D., Fragoso S. P., Krieger M. A. Internal control for real-time polymerase chain reaction based on MS2 bacteriophage for RNA viruses diagnostics. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz. 2017; 112 (5): 339–347. https://doi.org/10.1590/0074-02760160380Zambenedetti M. R., Pavoni D. P., Dallabona A. C., Dominguez A. C., Poersch C. de D., Fragoso S. P., Krieger M. A. Internal control for real-time polymerase chain reaction based on MS2 bacteriophage for RNA viruses diagnostics. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz. 2017; 112 (5): 339–347. https://doi.org/10.1590/0074-02760160380

The authors declare that there are no conflicts of interest present.