veterinaryВетеринария сегодняVeterinary Science Today2304-196X2658-6959"Veinard"10.29326/2304-196X-2024-13-1-87-94veterinary-795Research ArticleОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ | БИОТЕХНОЛОГИЯORIGINAL ARTICLES | BIOTECHNOLOGYИсследование методом проточной цитометрии динамики трансформации ДНК в культуре клеток ВНК-21/SUSP/ARRIAH при репродукции вируса бешенстваFlow cytometry study of DNA transformation dynamics in ВНК-21/SUSP/ARRIAH cell culture during rabies virus reproductionhttps://orcid.org/0000-0002-3997-3390ГусеваМ. Н.GusevaM. N.

Гусева Марина Николаевна, канд. биол. наук, старший научный сотрудник лаборатории профилактики ящура

мкр. Юрьевец, г. Владимир, 600901

Marina N. Guseva, Cand. Sci. (Biology), Senior Researcher, Laboratory for FMD Prevention

Yur’evets, Vladimir 600901

guseva_mn@arriah.ruhttps://orcid.org/0000-0002-4682-6559ДоронинМ. И.DoroninM. I.

Доронин Максим Игоревич, д-р биол. наук, ведущий научный сотрудник лаборатории профилактики ящура

мкр. Юрьевец, г. Владимир, 600901

Maksim I. Doronin, Dr. Sci. (Biology), Leading Researcher, Laboratory for FMD Prevention

Yur’evets, Vladimir 600901

doronin@arriah.ruhttps://orcid.org/0009-0006-5874-8363ШевченкоМ. А.ShevchenkoM. A.

Шевченко Максим Александрович, ведущий ветеринарный врач лаборатории профилактики ящура 

мкр. Юрьевец, г. Владимир, 600901

Maxim A. Shevchenko, Leading Veterinarian, Laboratory for FMD Prevention

Yur’evets, Vladimir 600901

shevchenko_ma@arriah.ruhttps://orcid.org/0000-0003-1718-1955МихалишинД. В.MikhalishinD. V.

Михалишин Дмитрий Валерьевич, д-р вет. наук, заведующий лабораторией профилактики ящура

мкр. Юрьевец, г. Владимир, 600901

Dmitry V. Mikhalishin, Dr. Sci. (Veterinary Medicine), Head of Laboratory for FMD Prevention

Yur’evets, Vladimir 600901

mihalishindv@arriah.ruhttps://orcid.org/0000-0001-9880-9657БорисовА. В.BorisovA. V.

Борисов Алексей Валерьевич, канд. вет. наук, начальник отдела лаборатории профилактики ящура

мкр. Юрьевец, г. Владимир, 600901

Alexey V. Borisov, Cand. Sci. (Veterinary Medicine), Head of Department, Laboratory for FMD Prevention

Yur’evets, Vladimir 600901

borisov_av@arriah.ruhttps://orcid.org/0000-0002-2986-8992ЕлькинаЮ. С.El’kinaYu. S.

Елькина Юлия Сергеевна, канд. вет. наук, младший научный сотрудник лаборатории профилактики ящура

мкр. Юрьевец, г. Владимир, 600901

Yulia S. El’kina, Cand. Sci. (Veterinary Medicine), Junior Researcher, Laboratory for FMD Prevention

Yur’evets, Vladimir 600901

elkina_ys@arriah.ruhttps://orcid.org/0009-0002-8403-8665ОковытаяТ. В.OkovytayaT. V.

Оковытая Татьяна Владимировна, канд. биол. наук, старший научный сотрудник лаборатории  профилактики ящура

мкр. Юрьевец, г. Владимир, 600901

Tatyana V. Okovytaya, Cand. Sci. (Biology), Senior Researcher, Laboratory for FMD Prevention

Yur’evets, Vladimir 600901

okovitaya@arriah.ruЗахаровВ. М.ZakharovV. М.

Захаров Валерий Михайлович, д-р вет. наук, профессор

мкр. Юрьевец, г. Владимир, 600901

Author ID: 7402991265

Valery M. Zakharov, Dr. Sci. (Veterinary Medicine), Professor

Yur’evets, Vladimir 600901

Author ID: 7402991265

zaharov@arriah.ruhttps://orcid.org/0009-0001-9538-5657МихалишинВ. В.MikhalishinV. V.

Михалишин Валерий Васильевич, д-р вет. наук, профессор, главный научный сотрудник  информационно-аналитического центра

мкр. Юрьевец, г. Владимир, 600901

Valery V. Mikhalishin, Dr. Sci. (Veterinary Medicine), Professor, Chief Researcher, Information and Analysis Centre

Yur’evets, Vladimir 600901

mihalishin@arriah.ruФГБУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» (ФГБУ «ВНИИЗЖ»)РоссияFederal Centre for Animal HealthRussian Federation2024150320241318794Copyright © Гусева М.Н., Доронин М.И., Шевченко М.А., Михалишин Д.В., Борисов А.В., Елькина Ю.С., Оковытая Т.В., Захаров В.М., Михалишин В.В., 20242024Гусева М.Н., Доронин М.И., Шевченко М.А., Михалишин Д.В., Борисов А.В., Елькина Ю.С., Оковытая Т.В., Захаров В.М., Михалишин В.В.Guseva M.N., Doronin M.I., Shevchenko M.A., Mikhalishin D.V., Borisov A.V., El’kina Y.S., Okovytaya T.V., Zakharov V.М., Mikhalishin V.V.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://veterinary.arriah.ru/jour/article/view/795

Исследование посвящено изучению динамики трансформации ДНК клеток сублинии ВНК-21/SUSP/ARRIAH при репродукции в них вируса бешенства. Инфицированные возбудителем и контрольные интактные клетки культивировались в аналогичных условиях. При выявлении зависимости инфекционности вируса от времени репродукции установили, что титр его инфекционной активности увеличивался от (3,2 ± 0,2) lg ККИД50/см3 при инокуляции до (7,63 ± 0,3) lg ККИД50/см3 через 48 ч репродукции, но более интенсивно он возрастал в первые 24 ч. Концентрация клеток при этом изменилась с 0,5 до 1,9 млн/см3, то есть выросла в 3,8 раза. Спустя 24 ч кратность прироста клеток замедлялась. В процессе изучения фаз клеточного цикла при репродукции в клетке-хозяине вируса бешенства получены результаты, позволяющие оценить продолжительность и доминирование фаз G1, S, G2 + M на разных этапах культивирования. Динамика изменений популяции клеток, находящихся в апоптозе, в контроле и опыте была одинаковой в течение 36 ч культивирования. По прошествии данного времени инфицированных клеток в стадии апоптоза было на 28–42% больше по сравнению с таковыми в контроле. Доля клеток, находящихся в стадии фазы G1, через 9 ч в опытных образцах увеличилась на 11,7%, в контрольных, наоборот, уменьшилась на 16,6%. В дальнейшем количество клеток в G1-фазе и в контроле, и в опыте изменялось одинаково: через 15–18 ч наблюдали уменьшение на 40%, далее – ростовой скачок на 45–46%, потом опять снижение на 39–40%, затем вновь увеличение. После 33 ч репродукции и до окончания культивирования доля инфицированных клеток, находящихся в фазе G1, была значительно больше (на 12–21%), чем контрольных. Количество клеток в фазе S в опыте и контроле в первые сутки репродукции вируса было одинаковым, при этом наблюдали резкое скачкообразное увеличение через 15 и 24 ч в 3,4 и 2,4 раза соответственно. Через 24 ч между инфицированными и контрольными клетками начали проявляться различия, которые постепенно возрастали с 8 до 137% к окончанию репродукции. В фазе G2 + M через 30 ч репродукции количество клеток опытных образцов начинало уменьшаться на 17–28% по сравнению с контрольными. Перестройка клетки на синтез полных частиц вируса бешенства наступала через 24 ч репродукции. Об этом говорят изменения в фазах клеточного цикла клетки-хозяина и замедление прироста самой популяции клеток линии ВНК-21/SUSP/ARRIAH.

The study examines the DNA transformation dynamics of ВНК-21/SUSP/ARRIAH subline cells during rabies virus reproduction. Cells infected with the virus and control intact cells were cultivated under similar conditions. The identification of dependence of the virus infectivity on reproduction time revealed that the virus infectivity titre increased from (3.2 ± 0.2) lg CCID50/cm3 at the time of inoculation to (7.63 ± 0.3) lg CCID50/cm3 after 48 hours of reproduction, with the most intensive increase having been observed within the first 24 hours. The cell concentration changed from 0.5 to 1.9 million/cm3, i.e. increased by a factor of 3.8. After 24 hours, the cell growth rate slowed down. Findings from the examination of cell cycle phases during rabies virus reproduction in the host cell allowed for the estimation of duration and predominance of G1, S, G2 + M phases at different stages of cultivation. The dynamics of changes in the apoptotic cell population in the control and test samples was similar within 36 hours of cultivation. After the said period, the proportion of apoptotic infected cells was 28–42% higher than that of apoptotic control cells. After 9 hours, the proportion of cells undergoing G1 phase increased by 11.7% in the test samples, whereas it decreased by 16.6% in the control samples. Subsequently, the number of G1 phase cells in the control and test samples changed in the same way: a 40% decrease was observed after 15–18 hours, it was followed by a 45–46% growth jump, then again a 39–40% decrease and an increase were observed. After 33 hours of reproduction and till the end of cultivation, the proportion of infected cells undergoing G1 phase was significantly higher (by 12–21%) as compared with control cells. The percentage of S phase cells in the test and control samples was the same during the first day of the virus reproduction, with sharp jump-like 3.4- and 2.4-fold increases having been observed after 15 and 24 hours, respectively. After 24 hours, the infected and control cells began to demonstrate differences, which gradually increased from 8 to 137% by the end of reproduction. After 30 hours of reproduction, the proportion of test sample cells undergoing G2 + M phase began to decrease by 17–28% as compared with the control cells. The cell switch-over to the synthesis of complete rabies virus particles occurred after 24 hours of reproduction. This is indicated by changes in the host cell cycle phases, as well as by the slowing down of ВНК-21/SUSP/ARRIAH cell population growth.

проточная цитометрияфазы клеточного цикласуспензия клеток ВНК-21вирус бешенстваflow cytometrycell cycle phasesВНК-21 cell suspensionrabies virusИсследование проведено за счет средств ФГБУ «ВНИИЗЖ» в рамках научно-исследовательских работ по теме «Ветеринарное благополучие».This work was funded by the Federal Centre for Animal Health within the scope of research activities “Veterinary Welfare”.ReferencesСюрин В. Н., Самуйленко А. Я., Соловьев Б. В., Фомина Н. В. Вирусные болезни животных. М.: ВНИТИБП; 2001. 928 с.Syurin V. N., Samuilenko A. Ya., Solovyev B. V., Fomina N. V. Viral Diseases of Animals. Moscow: VNITIBP; 2001. 928 p. (in Russ.)Груздев К. Н., Метлин А. Е. Бешенство животных. Владимир: ФГБУ «ВНИИЗЖ»; 2019. 394 с. EDN: FCSNOHGruzdev K. N., Metlin A. E. Animal Rabies. Vladimir: FGBI “ARRIAH”; 2019. 394 p. EDN: FCSNOH (in Russ.)Макаров В. В., Гулюкин А. М., Гулюкин М. И. Бешенство: естественная история на рубеже столетий. М.: ЗооВетКнига; 2015. 121 с. EDN: TXECJRMakarov V. V., Gulyukin A. M., Gulyukin M. I. Rabies: Natural History at Centuries Boundary. Moscow: ZooVetKniga; 2015. 121 p. EDN: TXECJR (in Russ.)Макаров В. В., Лозовой Д. А., Брико Н. И. Бешенство рукокрылых и человек. Эпидемиология и инфекционные болезни. Актуальные вопросы. 2015; 6: 46–53. EDN: VEAETLMakarov V. V., Lozovoy D. A., Briko N. I. Cheiropter rabies and man. Epidemiology and Infectious Diseases. Current Items. 2015; 6: 46–53. EDN: VEAETL (in Russ.)Метлин А. Е. Современные аспекты классификации лиссавирусов. Ветеринария сегодня. 2017; (3): 52–57. EDN: ZIGAFPMetlin A. Ye. Modern aspects of lyssavirus classification. Veterinary Science Today. 2017; (3): 52–57. EDN: ZIGAFP (in Russ.)Руководство по вирусологии. Вирусы и вирусные инфекции человека и животных. Под ред. Д. К. Львова. М.: Медицинское информационное агентство; 2013; 1200 с.Guidance on Virology. Human and Animal Viruses and Viral Infections. Ed. by D. K. Lvov. Moscow: Meditsinskoe informatsionnoe agentstvo; 2013. 1200 p. (in Russ.)Bourhy H., Cowley J. A., Larrous F., Holmes E. C., Walker P. J. Phylogenetic relationships among rhabdoviruses inferred using the L polymerase gene. Journal of General Virology. 2005; 86 (10): 2849–2858. https://doi.org/10.1099/vir.0.81128-0Bourhy H., Cowley J. A., Larrous F., Holmes E. C., Walker P. J. Phylogenetic relationships among rhabdoviruses inferred using the L polymerase gene. Journal of General Virology. 2005; 86 (10): 2849–2858. https://doi.org/10.1099/vir.0.81128-0Albertini A. A. V., Schoehn G., Weissenhorn W., Ruigrok R. W. H. Structural aspects of rabies virus replication. Cellular and Molecular Life Sciences. 2008; 65 (2): 282–294. https://doi.org/10.1007/s00018-007-7298-1Albertini A. A. V., Schoehn G., Weissenhorn W., Ruigrok R. W. H. Structural aspects of rabies virus replication. Cellular and Molecular Life Sciences. 2008; 65 (2): 282–294. https://doi.org/10.1007/s00018-007-7298-1Барабаш Е. Ю., Калинина Е. П., Гвозденко Т. А., Денисенко Ю. К., Новгородцева Т. П., Антонюк М. В., Ходосова К. К. Регуляция иммунного ответа у пациентов с частично контролируемой и контролируемой бронхиальной астмой. Медицинская иммунология. 2017; 19 (1): 65–72. https://doi.org/10.15789/1563-0625-2017-1-65-72Barabash E. Yu., Kalinina E. P., Gvozdenko T. A., Denisenko Yu. K., Novgorodtseva T. P., Antonyuk M. V., Khodosova K. K. Regulation of immuneimmune response of patients with partially controlled vs controlled bronchial asthma. Medical Immunology (Russia). 2017; 19 (1): 65–72. https://doi.org/10.15789/1563-0625-2017-1-65-72 (in Russ.)Войткова В. В. Изучение апоптоза методом проточной цитофлуориметрии (обзор литературы). Бюллетень Восточно-Сибирского научного центра Сибирского отделения Российской академии медицинских наук. 2010; 6-1 (76): 220–225. EDN: OHWEVVVoitkova V. V. Study of apoptosis with use of flow cytometry (review of literature). Bulletin of Eastern-Siberian Scientific Center. 2010; 6-1 (76): 220–225. EDN: OHWEVV (in Russ.)Ищенко И. О., Оппедизано М. Д. Л. Совершенствование оценки противоопухолевого иммунитета с использованием метода проточной цитометрии. Forcipe. 2019; 2 (4): 24–31. EDN: STCTRIIshchenko I. O., Oppedisano M. D. L. Improvement of antituminal immunity assessment using the method of flow cytometry. Forcipe. 2019; 2 (4): 24–31. EDN: STCTRI (in Russ.)Козырева В. С., Шилова А. Н., Шкода О. С. Использование метода проточной цитометрии для контроля содержания остаточных лейкоцитов в плазме крови. Гематология и трансфузиология. 2019; 64 (1): 66–72. https://doi.org/10.35754/0234-5730-2019-64-1-66-72Kozyreva V. S., Shilova A. N., Shkoda O. S. Flow cytometry for measuring residual leukocytes in blood plasma. Russian Journal of Hematology and Transfusiology. 2019; 64 (1): 66–72. https://doi.org/10.35754/0234-5730-2019-64-1-66-72 (in Russ.)Ягунов А. С., Карташев А. В., Токалов С. В., Киселева Л. Н. Основные этапы разработки и применения метода проточной цитометрии в ФГУ РНЦРХТ. Вопросы онкологии. 2008; 54 (4): 494–497. EDN: JVSUZBYagunov A. S., Kartashov A. V., Tokalov S. V., Kiseleva L. N. Main milestones of development and application of ductal cytometry at the Russian center for research in radiological and surgical techniques, St. Petersburg. Voprosy Onkologii = Problems in Oncology. 2008; 54 (4): 494–497. EDN: JVSUZB (in Russ.)Стахнёва Е. М., Рагино Ю. И. Современные методы исследования атеросклероза и ишемической болезни сердца: проточная цитометрия. Бюллетень сибирской медицины. 2021; 20 (2): 184–190. https://doi.org/10.20538/1682-0363-2021-2-184-190Stakhneva E. M., Ragino Yu. I. Modern methods for studying atherosclerosis and coronary artery disease: flow cytometry. Bulletin of Siberian Medicine. 2021; 20 (2): 184–190. https://doi.org/10.20538/1682-0363-2021-2-184-190Barnum K. J., O’Connell M. J. Cell cycle regulation by checkpoints. In: Cell Cycle Control. Methods in Molecular Biology. Eds. E. Noguchi, M. Gadaleta. 2014; 1170: 29–40. https://doi.org/10.1007/978-1-4939-0888-2_2Barnum K. J., O’Connell M. J. Cell cycle regulation by checkpoints. In: Cell Cycle Control. Methods in Molecular Biology. Eds. E. Noguchi, M. Gadaleta. 2014; 1170: 29–40. https://doi.org/10.1007/978-1-4939-0888-2_2Манин Б. Л., Ночевный В. Т., Хайдуков С. В., Ласкавый В. Н. Эффективность метода проточной цитометрии в изучении механизмов репарации клеток ВНК-21 в процессе культивирования и криоконсервирования. Ветеринарна медицина. 2011; 95: 66–70. EDN: SMUJVJManin B. L., Nochevny V. T., Khaidukov S. V., Laskavy V. N. Efficiency of flow cytometric analysis used to study of mechanisms of reparation of BHK-21 cells in the process of cultivation and cryoconservation. Veterinary Medicine. 2011; 95: 66–70. EDN: SMUJVJ (in Russ.)Sherman J., Wang R. Rapid profiling of G2 phase to mitosis progression by flow cytometry in asynchronous cells. Cell Cycle. 2020; 19 (21): 2897–2905. https://doi.org/10.1080/15384101.2020.1827510Sherman J., Wang R. Rapid profiling of G2 phase to mitosis progression by flow cytometry in asynchronous cells. Cell Cycle. 2020; 19 (21): 2897–2905. https://doi.org/10.1080/15384101.2020.1827510Rieger A. M. Flow cytometry and cell cycle analysis: An overview. In: Cell-Cycle Synchronization. Methods in Molecular Biology. Еd. Z. Wang. 2022; 2579: 47–57. https://doi.org/10.1007/978-1-0716-2736-5_4Rieger A. M. Flow cytometry and cell cycle analysis: An overview. In: Cell-Cycle Synchronization. Methods in Molecular Biology. Еd. Z. Wang. 2022; 2579: 47–57. https://doi.org/10.1007/978-1-0716-2736-5_4Kim K. H., Sederstrom J. M. Assaying cell cycle status using flow cytometry. Current Protocols in Molecular Biology. 2015; 111: 28.6.1–28.6.11. https://doi.org/10.1002/0471142727.mb2806s111Kim K. H., Sederstrom J. M. Assaying cell cycle status using flow cytometry. Current Protocols in Molecular Biology. 2015; 111: 28.6.1–28.6.11. https://doi.org/10.1002/0471142727.mb2806s111Nair A., Manohar S. M. A flow cytometric journey into cell cycle analysis. Bioanalysis. 2021; 13 (21): 1627–1644. https://doi.org/10.4155/bio-2021-0071Nair A., Manohar S. M. A flow cytometric journey into cell cycle analysis. Bioanalysis. 2021; 13 (21): 1627–1644. https://doi.org/10.4155/bio-2021-0071Клетки. Под ред. Б. Льюина, Л. Кассимериса, В. П. Лингаппы, Д. Плоппера. М.: БИНОМ. Лаборатория знаний; 2011. 951 с.Cells. Eds. B. Lewin, L. Cassimeris, V. R. Lingappa, G. Plopper. Sudbury (Massachusetts): Jones and Bartlett Publishers; 2007. 863 p.Гусева М. Н., Шевченко М. А., Михалишин Д. В., Михалишин В. В., Манин Б. Л. Изучение методом проточной цитометрии динамики трансформации ДНК в культуре клеток ВНК-21/2-17 при репродукции вируса ящура. Ветеринария сегодня. 2018; (4): 39–43. https://doi.org/10.29326/2304-196X-2018-4-27-39-43Guseva M. N., Shevchenko М. А., Mikhalishin D. V., Mikhalishin V. V., Manin B. L. Study of DNA transformation dynamics in ВНК-21/2-17 cell culture using flow cytometry during FMD virus reproduction. Veterinary Science Today. 2018; (4): 39–43. https://doi.org/10.29326/2304-196X-2018-4-27-39-43Шевченко М. А., Гусева М. Н., Михалишин Д. В., Манин Б. Л., Шишкова А. А. Исследование клеточного цикла линии ВНК-21/2-17 методом проточной цитометрии. Ветеринария сегодня. 2017; (4): 58–62. EDN: YKWANDShevchenko М. А., Guseva M. N., Mikhalishin D. V., Manin B. L., Shishkova A. A. Studies of the BHK-21/2-17 lineage using flow cytometry. Veterinary Science Today. 2017; (4): 58–62. EDN: YKWAND (in Russ.)Лозовой Д. А., Гусева М. Н., Михалишин Д. В., Доронин М. И., Манин Б. Л., Шишкова А. А. и др. ВНК-21/SUSP/ARRIAH – перевиваемая суспензионная сублиния клеток почки новорожденного сирийского хомячка, предназначенная для репродукции вирусов ящура, бешенства, парагриппа-3, болезни Ауески при производстве противовирусных вакцин, а также для изготовления диагностических и профилактических ветеринарных биопрепаратов. Патент № 2722671 С1 Российская Федерация, МПК С12N 5/10 (2006.01). ФГБУ «ВНИИЗЖ». № 2019131190. Заявл. 01.10.2019. Опубл. 02.06.2020. Бюл. № 16.Lozovoj D. A., Guseva M. N., Mikhalishin D. V., Doronin M. I., Manin B. L., Shishkova A. A., et al. BHK-21/SUSP/ARRIAH – continuous suspension subline of newborn Syrian hamster kidney cells, intended for reproduction of foot-and-mouth disease viruses, rabies, parainfluenza-3, Aujeszky’s disease in producing antiviral vaccines, as well as for making diagnostic and preventive veterinary biopreparations. Patent No. 2722671 C1 Russian Federation. Int. Cl. С12N 5/10 (2006.01). FGBI “ARRIAH”. No. 2019131190. Date of filing: 01.10.2019. Date of publication: 02.06.2020. Bull. No. 16.

The authors declare that there are no conflicts of interest present.