veterinaryВетеринария сегодняVeterinary Science Today2304-196X2658-6959"Veinard"10.29326/2304-196X-2023-12-2-171-177veterinary-733Research ArticleОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ | ВЕТЕРИНАРНАЯ МИКРОБИОЛОГИЯORIGINAL ARTICLES | VETERINARY MICROBIOLOGYОтработка режима низкотемпературной консервации штаммов Bacillus anthracisOptimizing a low-temperature preservation technique for Bacillus anthracis strainshttps://orcid.org/0000-0003-0853-5678РодионовА. П.RodionovA. P.

Родионов Александр Павлович, кандидат ветеринарных наук, младший научный сотрудник лаборатории коллекции штаммов микроорганизмов

420075, Республика Татарстан, г. Казань, Научный городок-2

Alexander P. Rodionov, Candidate of Science (Veterinary Medicine), Junior Researcher, Laboratory for Collection of Strains of Microorganisms

420075, Republic of Tatarstan, Kazan, Nauchnyi gorodok-2

alexandrvetspets@gmail.comhttps://orcid.org/0000-0002-6204-6077АртемьеваЕ. А.ArtemevaE. A.

Артемьева Елена Александровна, кандидат ветеринарных наук, заведующий лабораторией коллекции штаммов микроорганизмов

г. Казань, Республика Татарстан

Elena A. Artemeva, Candidate of Science (Veterinary Medicine), Head of Laboratory for Collection of Strains of Microorganisms

Kazan, Republic of Tatarstan

artemevaelena21@mail.ruhttps://orcid.org/0000-0002-0159-3843МельниковаЛ. А.MelnikovaL. A.

Мельникова Лилия Арсентьевна, кандидат ветеринарных наук, доцент, ведущий научный сотрудник лаборатории коллекции штаммов микроорганизмов

г. Казань, Республика Татарстан

Lilia A. Melnikova, Candidate of Science (Veterinary Medicine), Associate Professor, Leading Researcher, Laboratory for Collection of Strains of Microorganisms

Kazan, Republic of Tatarstan

vnivi@mail.ruhttps://orcid.org/0000-0003-2333-9704СахибуллинаД. М.SahibullinaD. M.

Сахибуллина Дания Минзагитовна, старший лаборант лаборатории коллекции штаммов микроорганизмов

г. Казань, Республика Татарстан

Daniya M. Sahibullina, Senior Laboratory Technician, Laboratory for Collection of Strains of Microorganisms

Kazan, Republic of Tatarstan

ФГБНУ «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности» (ФГБНУ «ФЦТРБ-ВНИВИ»)РоссияFSBSI “Federal Center for Toxicological, Radiation and Biological Safety” (FSBSI “FCTRBS-ARRVI”)Russian Federation202313062023122171177Copyright © Родионов А.П., Артемьева Е.А., Мельникова Л.А., Сахибуллина Д.М., 20232023Родионов А.П., Артемьева Е.А., Мельникова Л.А., Сахибуллина Д.М.Rodionov A.P., Artemeva E.A., Melnikova L.A., Sahibullina D.M.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://veterinary.arriah.ru/jour/article/view/733

Ключевой проблемой использования чистых культур микроорганизмов является их хранение, транспортировка, восстановление жизнеспособности после длительной консервации с сохранением ценных биологических свойств. Применяемые в настоящее время противосибиреязвенные вакцины создаются с использованием различных штаммов Bacillus anthracis. На сегодняшний день штаммы возбудителя сибирской язвы, согласно данным паспортов, консервируют в 30–40-процентных растворах глицерина, позволяющих сохранять достаточное количество жизнеспособных клеток, а также свойства возбудителя в течение трех лет. Очевидно, что разработка способа консервации штаммов Bacillus anthracis для более продолжительного хранения возбудителя является актуальной задачей. Целью работы было отработать режим низкотемпературной консервации штаммов Bacillus anthracis, обеспечивающий сохранность жизнеспособности и биологических свойств возбудителя. Для проведения исследований были отобраны два вакцинных штамма Bacillus anthracis: К-СТИ-79 и 55-ВНИИВВиМ, а также две криопротекторные среды: № 1 – 15%-й раствор глицерина с 15%-м раствором глюкозы и № 2 – 30%-й нейтральный раствор глицерина на физиологическом растворе. На первом этапе были изучены биологические свойства штаммов и подсчитано количество жизнеспособных клеток. После чего штаммы были помещены на низкотемпературную консервацию при минус 40 и минус 70 °С. Через 6 месяцев хранения изучали сохранность их жизнеспособности и биологических свойств при трех режимах разморозки: при комнатной темпера- туре (22 ± 2) °С, на водяной бане при температуре (37 ± 1) °С и в бытовом холодильнике при температуре (6 ± 2) °С. Было установлено, что наиболее подходящим режимом явилось хранение клеток при минус 70 °С и размораживание на водяной бане при (37 ± 1) °С. Дальнейшие исследования будут направлены на установление максимально возможной длительности хранения штаммов при низкотемпературном режиме консервации, при которой сохранятся жизнеспособность и биологические свойства возбудителя.

The use of pure microbial cultures is associated with the following key challenges: storage, transportation and resuscitation after a long-term preservation. The currently used anthrax vaccines are produced using various strains of Bacillus anthracis. According to the storage passport data, anthrax strains are now stored in 30–40% glycerin solutions, which helps to preserve a sufficient number of viable cells without losses to their pathogenic properties for three years. It is obviously an urgent task to develop a long-term preservation technique for Bacillus anthracis strains. The aim of this study was to optimize a low-temperature preservation method for Bacillus anthracis strains that ensures viability and no losses to biological properties of the pathogen. Two vaccine strains of Bacillus anthracis were selected for the research: i.e. K-STI-79 and 55-VNIIVViM and two cryoprotective media (No. 1 – 15% glycerin solution with 15% glucose solution and No. 2 – 30% neutral glycerin solution in saline solution). At first biological properties of the strains were studied and the number of viable cells was calculated. Later on, the strains were placed into low-temperature preservation facilities, at the temperature of –40 and –70 °C. Six months later, the effect of three thawing cycles on viability and biological properties of the agent was tested: i.e. at room temperature (22 ± 2) °C, in a water bath at a temperature of (37 ± 1) °C and in a household refrigerator at a temperature of (6 ± 2) °C. As demonstrated, the best option is to preserve the cells at –70 °C and thaw them in a water bath at (37 ± 1) °C. Further research will be focused on duration of the low-temperature preservation that will ensure appropriate viability and biological properties of the pathogen.

сибирская язваBacillus anthracisштаммынизкотемпературная консервацияanthraxBacillus anthracisstrainslow-temperature preservationРабота выполнена за счет средств ФГБНУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» в рамках научно-исследовательской работы по теме «Коллекционирование, поддержание, пополнение и хранение штаммов возбудителей особо опасных болезней (ООБ), организация их учета, проведение исследований по изучению биологических свойств и обеспечение предприятий агропромышленного комплекса штаммами возбудителей ООБ».The work was carried out using the funds of the FSBSI “FCTRBS-ARRVI” within the research “Collecting, maintaining, replenishing and storing strains of highly dangerous diseases (HDD), keeping records of them, studying their biological properties and providing agro-industry companies with HDD strains”.ReferencesHeylen K., Hoefman S., Vekeman B., Peiren J., De Vos P. Safeguarding bacterial resources promotes biotechnological innovation. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2012; 94: 565–574. DOI: 10.1007/s00253-011-3797-y.Heylen K., Hoefman S., Vekeman B., Peiren J., De Vos P. Safeguarding bacterial resources promotes biotechnological innovation. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2012; 94: 565–574. DOI: 10.1007/s00253-011-3797-y.Никитина З. К., Гордонова И. К., Насибов Э. М. Изучение коллагенолитических свойств коллекционных штаммов микромицетов при длительном хранении. Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. 2021; 24 (3): 33–39. DOI: 10.29296/25877313-2021-03-05.Nikitina Z. K., Gordonova I. K., Nasibov E. M. Collagenolytic properties of micromycetes collection strains during long-term storage study. Problems of biological, medical and pharmaceutical chemistry. 2021; 24 (3): 33−39. DOI: 10.29296/25877313-2021-03-05. (in Russ.)Артемьева Е. А., Мельникова Л. А., Родионов А. П. Опыт длительного хранения референтного штамма С-141 возбудителя мелиоидоза (Burkholderia pseudomallei). Ветеринария сегодня. 2022; 11 (3): 268–272. DOI: 10.29326/2304-196X-2022-11-3-268-272.Artemeva E. A., Melnikova L. A., Rodionov A. P. Long-term storage of C-141 reference strain of melioidosis agent (Burkholderia pseudomallei). Veterinary Science Today. 2022; 11 (3): 268–272. DOI: 10.29326/2304-196X-2022-11-3-268-272.Артемьева Е. А., Мельникова Л. А., Родионов А. П. Особенности подготовки и выдачи производственного штамма 5584 Burkholderia mallei в соответствии с требованиями биологической безопасности. Ветеринария сегодня. 2021; 10 (3): 243–247. DOI: 10.29326/2304-196X-2021-3-38-243-247.Artemeva E. A., Melnikova L. A., Rodionov A.  P. Preparation and transfer of Burkholderia mallei production strain 5584 in accordance with the biosafety requirements. Veterinary Science Today. 2021; 10 (3): 243–247. DOI: 10.29326/2304-196X-2021-3-38-243-247.Грачева И. В., Осин А. В. Низкотемпературная консервация коллекционных штаммов холерных вибрионов. Проблемы особо опасных инфекций. 2014; (4): 39–42. DOI: 10.21055/0370-1069-2014-4-39-42.Gracheva I. V., Osin A. L. Low-temperature conservation of collection cholera vibrio strains. Problems of ParticularlyDangerousInfections. 2014; (4): 39–42. DOI: 10.21055/0370-1069-2014-4-39-42. (in Russ.)Похиленко В. Д., Баранов А. М., Детушев К. В. Методы длительного хранения коллекционных культур микроорганизмов и тенденции развития. Известия высших учебных заведений. Поволжский регион. Медицинские науки. 2009; 4 (12): 99–121. EDN: LAKPFX.Pokhilenko V. D., Baranov А. М., Detushev К. V. Metody dlitel’nogo khraneniya kollektsionnykh kul’tur mikroorganizmov i tendentsii razvitiya = Methods of long-term storage for collection microbial cultures and their optimization. University proceedings. Volga region. Medical sciences. 2009; 4 (12): 99–121. EDN: LAKPFX. (in Russ.)Fissore D., McCoy T. Editorial: freeze-drying and process analytical technology for pharmaceuticals. Front. Chem. 2018; 6:622. DOI: 10.3389/fchem.2018.00622.Fissore D., McCoy T. Editorial: freeze-drying and process analytical technology for pharmaceuticals. Front. Chem. 2018; 6:622. DOI: 10.3389/fchem.2018.00622.Грачева И. В., Валова Т. В., Григорьева Г. В. Традиционные и новые защитные среды для низкотемпературной консервации бактерий. Проблемы особо опасных инфекций. 2011; (4): 36–40. DOI: 10.21055/0370-1069-2011-4(110)-36-40.Gracheva I. V., Valova T. V., Grigor’eva G. V. Traditional and modern protective media for the low-temperature bacteria preservation. Problems of Particularly Dangerous Infections. 2011; (4): 36–40. DOI: 10.21055/0370-1069-2011-4(110)-36-40. (in Russ.)Молчанова Е. В., Агеева Н. П. Научно-методические аспекты совершенствования деятельности коллекции патогенных микроорганизмов Волгоградского научно-исследовательского противочумного института. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2018; 95 (3): 117–126. DOI: 10.36233/0372-9311-2018-3-117-126.Molchanova E. V., Ageeva N. P. Scientific and methodologicalsupport for development of pathogenic microorganism collection of Volgograd research institute for plague control. Journal of Microbiology, Epidemiology and Immunobiology. 2018; 95 (3): 117–126. DOI: 10.36233/0372-9311-2018-3-117-126. (in Russ.)Cui S., Hu K., Qian Z., Mao B., Zhang Q., Zhao J., et al. Improvement of freeze-dried survival of Lactiplantibacillus plantarum based on cell membrane regulation. Microorganisms. 2022; 10 (10):1985. DOI: 10.3390/microorganisms10101985.Cui S., Hu K., Qian Z., Mao B., Zhang Q., Zhao J., et al. Improvement of freeze-dried survival of Lactiplantibacillus plantarum based on cell membrane regulation. Microorganisms. 2022; 10 (10):1985. DOI: 10.3390/microorganisms10101985.Малахаева А. Н., Ляшова О. Ю., Плотников О. П., Осин А. В. Хранение штаммов Francisella tularensis 15 НИИЭГ и Brucella abortus 19 ВА в жизнеспособном состоянии путем их глубокого замораживания. Проблемы особо опасных инфекций. 2015; (1): 63–66. DOI: 10.21055/0370-1069-2015-1-63-66.Malakhaeva A. N., Lyashova O. Yu., Plotnikov O. P., Osin A. V. Maintenance of Francisella tularensis 15 RIEH and Brucella abortus 19 BA strainsin a viable state by means of deep freezing. Problems of ParticularlyDangerousInfections. 2015; (1): 63–66. DOI: 10.21055/0370-1069-2015-1-63-66. (in Russ.)Савкина О. А., Терновской Г. В., Локачук М. Н., Павловская Е. Н., Сафронова В. И. Криоконсервация – перспективный метод хранения промышленно ценных штаммов молочнокислых бактерий и дрожжей. Сельскохозяйственная биология. 2014; 49 (4): 112–119. DOI: 10.15389/agrobiology.2014.4.112rus.Savkina O. A., Ternovskoi G. V., Lokachuk M. N., Pavlovskaya E. N., Safronova V. I. Cryopreservation to be a progressive method for keeping up valuable strains of lactic acid bacteria and yeasts. Agricultural Biology. 2014; 49 (4): 112–119. DOI: 10.15389/agrobiology.2014.4.112rus. (in Russ.)Ермолова В. П., Гришечкина С. Д., Нижников А. А. Активность энтомопатогенных штаммов-продуцентов Bacillusthuringiensis var. israelensis при разных методах хранения. Сельскохозяйственная биология. 2018; 53 (1): 201–208. DOI: 10.15389/agrobiology.2018.1.201rus.Ermolova V. P., Grishechkina S. D., Nizhnikov A. A. Activity of insecticidal Bacillus thuringiensis var. Israelensis strains stored by various methods. Agricultural Biology. 2018; 53 (1): 201–208. DOI: 10.15389/agrobiology.2018.1.201eng.Liu M., Chen C., Yu J., Zhang H., Liang L., Guo B., et al. The gelatin-based liquid marbles for cell cryopreservation. Mater. Today Bio. 2022; 17:100477. DOI: 10.1016/j.mtbio.2022.100477.Liu M., Chen C., Yu J., Zhang H., Liang L., Guo B., et al. The gelatinbased liquid marbles for cell cryopreservation. Mater. Today Bio. 2022; 17:100477. DOI: 10.1016/j.mtbio.2022.100477.Ali P., Fucich D., Shah A. A., Hasan F., Chen F. Cryopreservation of cyanobacteria and eukaryotic microalgae using exopolysaccharide extracted from a glacier bacterium. Microorganisms. 2021; 9 (2):395. DOI: 10.3390/microorganisms9020395.Ali P., Fucich D., Shah A. A., Hasan F., Chen F. Cryopreservation of cyanobacteria and eukaryotic microalgae using exopolysaccharide extracted from a glacier bacterium. Microorganisms. 2021; 9 (2):395. DOI: 10.3390/microorganisms9020395.Сидорчук А. А. История создания вакцин и вакцинации. Часть II. Оспа и сибирская язва. Российский ветеринарный журнал. 2018; (6): 12–14. DOI: 10.32416/article_5c050ab91c6a36.36611669.Sidorchuk A. A. History of vaccines and vaccination. Part II. Рox and anthrax. Russian Veterinary Journal. 2018; (6): 12–14. DOI: 10.32416/article_ 5c050ab91c6a36.36611669. (in Russ.)Сидорчук А. А. История создания вакцин и вакцинации. Часть III. Бешенство и туберкулез. Российский ветеринарный журнал. 2019; (2): 25–28. DOI: 10.32416/article_5cd16d076a75a6.23029629.Sidorchuk A. A. History of vaccines and vaccination. Part III. Rabies and tuberculosis. Russian Veterinary Journal. 2019; (2): 25–28. DOI: 10.32416/article_5cd16d076a75a6.23029629. (in Russ.)Сидорчук А. А. История создания вакцин и вакцинации. Часть IV. Чума и контагиозная плевропневмония крупного рогатого скота. Российский ветеринарный журнал. 2019; (6): 35–38. DOI: 10.32416/2500-4379-2019-2019-6-35-38.Sidorchuk A. A. History of vaccines and vaccination. Part IV. Rinderpest and contagious pleuropneumonia of cattle. Russian Veterinary Journal. 2019; (6): 35–38. DOI: 10.32416/2500-4379-2019-2019-6-35-38. (in Russ.)Сидорчук А. А. История создания вакцин и вакцинации. Часть V. Ящур. Российский ветеринарный журнал. 2020; (2): 27–30. DOI: 10.32416/2500-4379-2020-2-27-30.Sidorchuk A.  A. History of vaccines and vaccination. Part V. Foot-and-mouth disease. Russian Veterinary Journal. 2020; (2): 27–30. DOI: 10.32416/2500-4379-2020-2-27-30. (in Russ.)Родионов А. П., Артемьева Е. А., Мельникова Л. А., Косарев М. А., Иванова С. В. Особенности природной очаговости сибирской язвы и экологии Bacillus anthracis. Ветеринария сегодня. 2021; (2): 151–158. DOI: 10.29326/2304-196X-2021-2-37-151-158.Rodionov A. P., Artemeva E. A., Melnikova L. A., Kosarev M. A., Ivanova S. V. Features of anthrax natural foci and Bacillus anthracis ecology. Veterinary Science Today. 2021; (2): 151–158. DOI: 10.29326/2304-196X-2021-2-37-151-158.Лягоскин И. В., Васина Н. К., Егорова И. Ю., Селянинов Ю. О. Конструирование сибиреязвенных эритроцитарных антигенных диагностикумов. Вестник Российской академии сельскохозяйственных наук. 2012; (6): 73–76. EDN: PMBHXL.Lyagoskin I. V., Vasina N. K., Yegorova I. Yu., Selyaninov Yu. O. Constructing anthrax erythrocyte antigenic diagnosticums. Vestnik ofthe Russian agriculturalscience. 2012; (6): 73–76. EDN: PMBHXL. (in Russ.)Егорова И. Ю., Севских Т. А., Селянинов Ю. О. Иммунобиологические свойства нового бескапсульного штамма Bacillus anthracis 363/11. Биотехнология. 2015; 31 (5): 34–40. EDN: VLDZXL.Egorova I. Yu., Sevskii T. A., Selyaninov Yu. O. Immunobiological properties of new unencapsulated Bacillus anthracis 363/11 strain. Appl. Biochem. Microbiol. 2016; 52 (8): 733–738. DOI: 10.1134/S0003683816080044.Жилченко Е. Б., Жаринова Н. В., Сердюк Н. С., Коняева О. А., Гаврилова О. Н. Обеспечение биологической безопасности при лиофилизации микроорганизмов I–II групп патогенности. Здоровье населения и среда обитания – ЗНиСО. 2019; (1): 46–50. DOI: 10.35627/2219-5238/2019-310-1-46-50.Zhilchenko E. B., Zharinova N. V., Serdyuk N. S., Konyaeva O. A., Gavrilova O. N. Ensuring biological safety during lyophilization for microorganisms of I–II pathogenicity groups. PublicHealth and Life Environment – PH&LE. 2019; (1): 46–50. DOI: 10.35627/2219-5238/2019-310-1-46-50. (in Russ.)Баврина А. П. Современные правила применения параметрических и непараметрических критериев в статистическом анализе медико-биологических данных. Медицинский альманах. 2021; 1 (66): 64–73. EDN: IZXMBZ.Bavrina А. P. Modern rulesfor the use of parametric and nonparametric toolsin the statistical analysis of biomedical data. Medical Almanac. 2021; 1 (66): 64–73. EDN: IZXMBZ. (in Russ.)Hubálek Z. Protectants used in the cryopreservation of microorganisms. Cryobiology. 2003; 46 (3): 205–229. DOI: 10.1016/s0011-2240(03)00046-4.HubálekZ. Protectantsusedinthecryopreservationofmicroorganisms. Cryobiology. 2003; 46 (3): 205–229. DOI: 10.1016/s0011-2240(03)00046-4.Hasan M., Fayter A. E. R, Gibson M. I. Ice recrystallization inhibiting polymers enable glycerol-free cryopreservation of microorganisms. Biomacromolecules. 2018; 19 (8): 3371–3376. DOI: 10.1021/acs.biomac.8b00660.Hasan M., Fayter A. E. R, Gibson M. I. Ice recrystallization inhibiting polymers enable glycerol-free cryopreservation of microorganisms. Biomacromolecules. 2018; 19 (8): 3371–3376. DOI: 10.1021/acs.biomac.8b00660.

The authors declare that there are no conflicts of interest present.