veterinaryВетеринария сегодняVeterinary Science Today2304-196X2658-6959"Veinard"10.29326/2304-196X-2022-11-3-262-267veterinary-660Research ArticleОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ | БИОТЕХНОЛОГИЯORIGINAL ARTICLES | BIOTECHNOLOGYОптимизация состава питательной среды и изучение стадий роста изолята «Калуга 2020» Mycoplasma bovisOptimization of medium composition and study of growth stages of Mycoplasma bovis “Kaluga 2020” isolatehttps://orcid.org/0000-0002-1210-0303Абед АлхуссенМ.Abed AlhussenM.

Абед Алхуссен Мохаммад, аспирант департамента ветеринарной медицины аграрно-технологического института

117198, Москва, ул. Миклухо-Маклая, 6

Mohammad Abed Alhussen, Post-Graduate Student, Department of Veterinary Medicine, Agrarian and Technological Institute

Moscow

alhussenmohammed85@hotmail.comhttps://orcid.org/0000-0002-4288-1964НестеровА. А.NesterovA. A.

Нестеров Александр Александрович, кандидат ветеринарных наук, старший научный сотрудник референтной лаборатории болезней крупного рогатого скота

г. Владимир

Alexander А. Nesterov, Candidate of Science (Veterinary Medicine), Senior Researcher, Reference Laboratory for Bovine Diseases

Vladimir

nesterov@arriah.ruhttps://orcid.org/0000-0001-5982-3675СпрыгинА. В.SpryginA. V.

Спрыгин Александр Владимирович, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник референтной лаборатории болезней крупного рогатого скота

г. Владимир

Alexander V. Sprygin, Candidate of Science (Biology), Senior Researcher, Reference Laboratory for Bovine Diseases

Vladimir

sprygin@arriah.ruhttps://orcid.org/0000-0001-6132-5771ШумиловаИ. Н.ShumilovaI. N.

Шумилова Ирина Николаевна, кандидат ветеринарных наук, старший научный сотрудник референтной лаборатории болезней крупного рогатого скота

г. Владимир

Irina N. Shumilova, Candidate of Science (Veterinary Medicine), Senior Researcher, Reference Laboratory for Bovine Diseases

Vladimir

shumilova@arriah.ruБрянцеваМ. С.BryantsevaM. S.

Брянцева Мария Сергеевна, ведущий биолог лаборатории профилактики болезней свиней и рогатого скота

г. Владимир

Maria S. Bryantseva, Leading Biologist, Laboratory for Porcine and Horned Livestock Prevention

Vladimir

bryantseva@arriah.ruhttps://orcid.org/0000-0002-8326-7151БьядовскаяО. П.ByadovskayaO. P.

Бьядовская Ольга Петровна, кандидат биологических наук, заведующий референтной лабораторией болезней крупного рогатого скота

г. Владимир

Olga P. Byadovskaya, Candidate of Science (Biology), Head of Reference Laboratory for Bovine Diseases

Vladimir

bjadovskaya@arriah.ruФГАОУ ВО «Российский университет дружбы народов» (РУДН)РоссияPeople’s Friendship Universityof Russia (RUDN University)Russian FederationФГБУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» (ФГБУ «ВНИИЗЖ»)РоссияFGBI “Federal Centrefor Animal Health” (FGBI “ARRIAH”)Russian Federation202219092022113262267Copyright © Абед Алхуссен М., Нестеров А.А., Спрыгин А.В., Шумилова И.Н., Брянцева М.С., Бьядовская О.П., 20222022Абед Алхуссен М., Нестеров А.А., Спрыгин А.В., Шумилова И.Н., Брянцева М.С., Бьядовская О.П.Abed Alhussen M., Nesterov A.A., Sprygin A.V., Shumilova I.N., Bryantseva M.S., Byadovskaya O.P.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://veterinary.arriah.ru/jour/article/view/660

Mycoplasma bovis является одним из возбудителей микоплазмозов крупного рогатого скота, вызывающим респираторные болезни, мастит, артрит и кератоконъюнктивит. В статье представлены результаты исследования по оптимизации компонентного состава питательной среды для культивирования изолята «Калуга 2020» Mycoplasma bovis, а также изучения стадий роста возбудителя. Для определения активности микоплазм использовали метод измерения цветоизменяющих единиц и культуральный метод с подсчетом колониеобразующих единиц. Установлено, что при культивировании в оптимизированной питательной среде на основе модифицированного бульона Хейфлика микроорганизм вступает в фазу логарифмического роста по истечении первых 24 ч роста, через 72 ч культура микоплазм переходит в стабильный период, а через 84 ч регистрируется фаза спада. Влияние процентного содержания глюкозы, свежего дрожжевого экстракта и сыворотки крови лошади в питательной среде на накопление изолята «Калуга 2020» Mycoplasma bovis оценивали с использованием метода «один фактор за раз». Было установлено, что наибольшее влияние на накопление микоплазм оказывало содержание в питательной среде таких факторов роста, как свежий дрожжевой экстракт и сыворотка крови лошади (p < 0,05), в то время как изменение количества глюкозы не стимулировало рост Mycoplasma bovis. В результате проведенных исследований определен подходящий состав и подобрано оптимальное содержание факторов роста в среде для культивирования изолята «Калуга 2020» Mycoplasmabovis: 12,5% свежего дрожжевого экстракта и 25% сыворотки крови лошади. Применение оптимизированной питательной среды на основе модифицированного бульона Хейфлика позволило увеличить накопление биомассы микоплазм в 5 раз (3,98 × 109  КОЕ/мл) по сравнению со стандартной средой (0,79 × 109  КОЕ/мл).

Mycoplasma bovis is considered one of bovine mycoplasmosis pathogens responsible for respiratory diseases, mastitis, arthritis and keratoconjunctivitis. The paper presents results of the study on optimizing the component composition of the culture medium for Mycoplasma bovis “Kaluga 2020” isolate, as well as the study of this pathogen’s growth stages. The color-changing units assay and the culture method combined with colony-forming unit quantification were used for determination of Mycoplasma activity. It was found that when cultured in an optimized nutrient medium based on modified Hayflick broth, the microorganism enters a logarithmic growth phase after first 24 hours ofgrowth, in 72 hours the Mycoplasma culture enters astability phase, and adecline phase is recorded in 84 hours. The effect of percentage content of glucose, fresh yeast extract and horse serum in the nutrient medium on accumulation of Mycoplasma bovis “Kaluga2020” isolate was evaluated using the one-factor-at-a-time approach. It was found that the greatest effect on Mycoplasma accumulation was exerted by such growth factors as fresh yeast extract and horse serum in the nutrient medium (p < 0.05), while changes in the amount of glucose did not stimulate Mycoplasma bovis growth. Based on results of the conducted studies, the appropriate composition was determined and the optimal content of growth factors in the medium for culturing Mycoplasma bovis “Kaluga 2020” isolate was selected: 12.5%of fresh yeast extract and 25% of horse serum. The use of the optimized nutrient medium based on modified Hayflick broth allowed 5-fold increase in accumulation of Mycoplasma biomass (3.98 × 109CFU/ml)compared to the standard medium (0.79 × 109CFU/ml).

Mycoplasma bovisкрупный рогатый скотизолят «Калуга 2020»оптимизацияпитательные средыколониеобразующие единицы (КОЕ)цветоизменяющая единица (ЦИЕ)биологическая активностьMycoplasma boviscattle“Kaluga 2020” isolateoptimizationnutrient mediacolony-forming units (CFU)color-changing unit (CCU)biological activityReferencesАбед Алхуссен М., Нестеров А. А., Кирпиченко В. В., Яцентюк С. П., Спрыгин А. В., Бьядовская О. П., Кононов А. В. Распространение микоплазмозов крупного рогатого скота на животноводческих фермах в Российской Федерации в период с 2015 по 2018 год. Ветеринария сегодня. 2020; (2): 102–108. DOI:10.29326/2304-196X-2020-2-33-102-108.Abed Alhussen M., Nesterov A. A., Kirpichenko V. V., Yatsentyuk S. P., Sprygin A. V., Byadovskaya O. P., Kononov A. V. Bovine mycoplasmosis occurrence on livestock farms in the Russian Federation for 2015–2018. Veterinary Science Today. 2020; (2): 102–108. DOI:10.29326/2304-196X2020-2-33-102-108.Parker A. M., Sheehy P. A., Hazelton M. S., Bosward K. L., House J. K. A review of mycoplasma diagnostics in cattle. J. Vet. Intern. Med. 2018; 32 (3): 1241–1252. DOI:10.1111/jvim.15135.Parker A. M., Sheehy P. A., Hazelton M. S., Bosward K. L., House J. K. A review of mycoplasma diagnostics in cattle. J. Vet. Intern. Med. 2018; 32 (3): 1241–1252. DOI:10.1111/jvim.15135.Kurćubić V., Doković R., Ilić Z., Petrović M. Etiopathogenesis and economic significance of bovine respiratory disease complex (BRDC). Acta Agric. Serbica. 2018; 23 (45): 85–100. DOI:10.5937/AASer1845085K.Kurćubić V., Doković R., Ilić Z., Petrović M. Etiopathogenesis and economic significance of bovine respiratory disease complex (BRDC). Acta Agric. Serbica. 2018; 23 (45): 85–100. DOI:10.5937/AASer1845085K.Niu J., Wang D., Yan M., Chang Z., Xu Y., Sizhu S., et al. Isolation, identification and biological characteristics of Mycoplasma bovis in yaks. Microb. Pathog. 2021; 150:104691. DOI:10.1016/j.micpath.2020.104691.Niu J., Wang D., Yan M., Chang Z., Xu Y., Sizhu S., et al. Isolation, identification and biological characteristics of Mycoplasma bovis in yaks. Microb. Pathog. 2021; 150:104691. DOI:10.1016/j.micpath.2020.104691.Hale H. H., Helmboldt C. F., Plastridge W. N., Stula E. F. Bovine mastitis caused by a Mycoplasma species. Cornell Vet. 1962; 52: 582–591. PMID:13952069.Hale H. H., Helmboldt C. F., Plastridge W. N., Stula E. F. Bovine mastitis caused by a Mycoplasma species. Cornell Vet. 1962; 52: 582–591. PMID:13952069.Абед Алхуссен М., Кирпиченко В. В., Яцентюк С. П., Нестеров А. А., Бьядовская О. П., Жбанова Т. В., Спрыгин А. В. Патогенные микоплазмы крупного рогатого скота Mycoplasma bovis, M. bovigenitalium и M. dispar: краткая характеристика возбудителей (обзор). Сельскохозяйственная биология. 2021; 56 (2): 245–260. DOI:10.15389/agrobiology.2021.2.245rus.Abed Alhussen M., Kirpichenko V. V., Yatsentyuk S. P., Nesterov A. A., Byadovskaya O. P., Zhbanova T. V., Sprygin A. V. Mycoplasma bovis, M. bovigenitalium and M. dispar as bovine pathogens: brief characteristics of the pathogens (review). Agricultural Biology. 2021; 56 (2): 245–260. DOI:10.15389/agrobiology.2021.2.245eng.Nicholas R. A., Ayling R. D. Mycoplasma bovis: disease, diagnosis, and control. Res. Vet. Sci. 2003; 74 (2): 105–112. DOI:10.1016/s00345288(02)00155-8.Nicholas R. A., Ayling R. D. Mycoplasma bovis: disease, diagnosis, and control. Res. Vet. Sci. 2003; 74 (2): 105–112. DOI:10.1016/s00345288(02)00155-8.Andersson A. M., Aspán A., Wisselink H. J., Smid B., Ridley A., Pelkonen S., et al. European inter-laboratory trial to evaluate the performance of three serological methods for diagnosis of Mycoplasma bovis infection in cattle using latent class analysis. BMC Vet. Res. 2019; 15 (1): 369. DOI:10.1186/s12917-019-2117-0.Andersson A. M., Aspán A., Wisselink H. J., Smid B., Ridley A., Pelkonen S., et al. European inter-laboratory trial to evaluate the performance of three serological methods for diagnosis of Mycoplasma bovis infection in cattle using latent class analysis. BMC Vet. Res. 2019; 15 (1): 369. DOI:10.1186/s12917-019-2117-0.Montagnani F., Rossetti B., Vannoni A., Cusi M. G., De Luca A. Laboratory diagnosis of Mycoplasma pneumoniae infections: data analysis from clinical practice. New Microbiol. 2018; 41 (3): 203–207. PMID:29874388.Montagnani F., Rossetti B., Vannoni A., Cusi M. G., De Luca A. Laboratory diagnosis of Mycoplasma pneumoniae infections: data analysis from clinical practice. New Microbiol. 2018; 41 (3): 203–207. PMID:29874388.Pfützner H., Sachse K. Mycoplasma bovis as an agent of mastitis, pneumonia, arthritis and genital disorders in cattle. Rev. Sci. Tech. 1996; 15 (4): 1477–1494. DOI:10.20506/rst.15.4.987.Pfützner H., Sachse K. Mycoplasma bovis as an agent of mastitis, pneumonia, arthritis and genital disorders in cattle. Rev. Sci. Tech. 1996; 15 (4): 1477–1494. DOI:10.20506/rst.15.4.987.Poumarat F., Longchambon D., Martel J. L. Application of dot immunobinding on membrane filtration (MF dot) to the study of relationships within “M. mycoides cluster” and within “glucose and arginine-negative cluster” of ruminant mycoplasmas. Vet. Microbiol. 1992; 32 (3–4): 375–90. DOI:10.1016/0378-1135(92)90159-q.Poumarat F., Longchambon D., Martel J. L. Application of dot immunobinding on membrane filtration (MF dot) to the study of relationships within “M. mycoides cluster” and within “glucose and arginine-negative cluster” of ruminant mycoplasmas. Vet. Microbiol. 1992; 32 (3–4): 375–90. DOI:10.1016/0378-1135(92)90159-q.Nicholas R., Baker S. Recovery of mycoplasmas from animals. Methods Mol. Biol. 1998; 104: 37–43. DOI:10.1385/0-89603-525-5:37.Nicholas R., Baker S. Recovery of mycoplasmas from animals. Methods Mol. Biol. 1998; 104: 37–43. DOI:10.1385/0-89603-525-5:37.Hwang M. H., Damte D., Cho M. H., Kim Y. H., Park S. C. Optimization of culture media of pathogenic Mycoplasma hyopneumoniae by a response surface methodology. J. Vet. Sci. 2010; 11 (4): 327–332. DOI:10.4142/jvs.2010.11.4.327.Hwang M. H., Damte D., Cho M. H., Kim Y. H., Park S. C. Optimization of culture media of pathogenic Mycoplasma hyopneumoniae by a response surface methodology. J. Vet. Sci. 2010; 11 (4): 327–332. DOI:10.4142/jvs.2010.11.4.327.Duta F. P., De França F. P., Sérvulo E. F. C., De Almeida Lopes L. M., Da Costa A. C. A., Barros A. Effect of process parameters on production of a biopolymer by Rhizobium sp. Appl. Biochem. Biotechnol. 2004; 114: 639–652. DOI:10.1385/abab:114:1-3:639.Duta F. P., De França F. P., Sérvulo E. F. C., De Almeida Lopes L. M., Da Costa A. C. A., Barros A. Effect of process parameters on production of a biopolymer by Rhizobium sp. Appl. Biochem. Biotechnol. 2004; 114: 639–652. DOI:10.1385/abab:114:1-3:639.Assunção P., Rosales R. S., Rifatbegović M., Antunes N. T., de la Fe C., Ruiz de Galarreta C. M., Poveda J. B. Quantification of mycoplasmas in broth medium with sybr green-I and flow cytometry. Front. Biosci. 2006; 11: 492–497. DOI:10.2741/1812.Assunção P., Rosales R. S., Rifatbegović M., Antunes N. T., de la Fe C., Ruiz de Galarreta C. M., Poveda J. B. Quantification of mycoplasmas in broth medium with sybr green-I and flow cytometry. Front. Biosci. 2006; 11: 492–497. DOI:10.2741/1812.Hayflick L. Tissue cultures and mycoplasmas. Tex. Rep. Biol. Med. 1965; 23: Suppl 1:285–303. PMID:5833547.Hayflick L. Tissue cultures and mycoplasmas. Tex. Rep. Biol. Med. 1965; 23: Suppl 1:285–303. PMID:5833547.Garcia-Morante B., Dors A., León-Kempis R., Pérez de Rozas A., Segalés J., Sibila M. Assessment of the in vitro growing dynamics and kinetics of the non-pathogenic J and pathogenic 11 and 232 Mycoplasma hyopneumoniae strains. Vet. Res. 2018; 49 (1):45. DOI:10.1186/s13567-018-0541-y.Garcia-Morante B., Dors A., León-Kempis R., Pérez de Rozas A., Segalés J., Sibila M. Assessment of the in vitro growing dynamics and kinetics of the non-pathogenic J and pathogenic 11 and 232 Mycoplasma hyopneumoniae strains. Vet. Res. 2018; 49 (1):45. DOI:10.1186/s13567-018-0541-y.Friis N. F. Some recommendations concerning primary isolation of Mycoplasma suipneumoniae and Mycoplasma flocculare a survey. Nord. Vet. Med. 1975; 27 (6): 337–339. PMID:1098011.Friis N. F. Some recommendations concerning primary isolation of Mycoplasma suipneumoniae and Mycoplasma flocculare a survey. Nord. Vet. Med. 1975; 27 (6): 337–339. PMID:1098011.Poveda J. B., Nicholas R. Serological identification of mycoplasmas by growth and metabolic inhibition tests. Methods Mol. Biol. 1998; 104: 105–111. DOI:10.1385/0-89603-525-5:105.Poveda J. B., Nicholas R. Serological identification of mycoplasmas by growth and metabolic inhibition tests. Methods Mol. Biol. 1998; 104: 105–111. DOI:10.1385/0-89603-525-5:105.Calus D., Maes D., Vranckx K., Villareal I., Pasmans F., Haesebrouck F. Validation of ATP luminometry for rapid and accurate titration of Mycoplasma hyopneumoniae in Friis medium and a comparison with the color changing units assay. J. Microbiol. Methods. 2010; 83 (3): 335–340. DOI:10.1016/j.mimet.2010.09.001.Calus D., Maes D., Vranckx K., Villareal I., Pasmans F., Haesebrouck F. Validation of ATP luminometry for rapid and accurate titration of Mycoplasma hyopneumoniae in Friis medium and a comparison with the color changing units assay. J. Microbiol. Methods. 2010; 83 (3): 335–340. DOI:10.1016/j.mimet.2010.09.001.Jiang Z., Li S., Zhu C., Zhou R., Leung P. H. M. Mycoplasma pneumoniae infections: Pathogenesis and vaccine development. Pathogens. 2021; 10 (2):119. DOI:10.3390/pathogens10020119.Jiang Z., Li S., Zhu C., Zhou R., Leung P. H. M. Mycoplasma pneumoniae infections: Pathogenesis and vaccine development. Pathogens. 2021; 10 (2):119. DOI:10.3390/pathogens10020119.Stemke G. W., Robertson J. A. The growth response of Mycoplasma hyopneumoniae and Mycoplasma flocculare based upon ATP-dependent luminometry. Vet. Microbiol. 1990; 24 (2): 135–142. DOI:10.1016/03781135(90)90061-y.Stemke G. W., Robertson J. A. The growth response of Mycoplasma hyopneumoniae and Mycoplasma flocculare based upon ATP-dependent luminometry. Vet. Microbiol. 1990; 24 (2): 135–142. DOI:10.1016/03781135(90)90061-y.Cook B. S., Beddow J. G., Manso-Silván L., Maglennon G. A., Rycroft A. N. Selective medium for culture of Mycoplasma hyopneumoniae. Vet. Microbiol. 2016; 195: 158–164. DOI:10.1016/j.vetmic.2016.09.022.Cook B. S., Beddow J. G., Manso-Silván L., Maglennon G. A., Rycroft A. N. Selective medium for culture of Mycoplasma hyopneumoniae. Vet. Microbiol. 2016; 195: 158–164. DOI:10.1016/j.vetmic.2016.09.022.Friis N. F., Szancer J. Sensitivity of certain porcine and bovine mycoplasmas to antimicrobial agents in a liquid medium test compared to a disc assay. Acta Vet. Scand. 1994; 35 (4): 389–394. DOI:10.1186/BF03548313.Friis N. F., Szancer J. Sensitivity of certain porcine and bovine mycoplasmas to antimicrobial agents in a liquid medium test compared to a disc assay. Acta Vet. Scand. 1994; 35 (4): 389–394. DOI:10.1186/BF03548313.

The authors declare that there are no conflicts of interest present.