veterinaryВетеринария сегодняVeterinary Science Today2304-196X2658-6959"Veinard"10.29326/2304-196X-2022-11-2-149-155veterinary-643Research ArticleОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ | БИОТЕХНОЛОГИЯORIGINAL ARTICLES | BIOTECHNOLOGYОпределение репродуктивных свойств вируса классической чумы свиней вирулентных и вакцинных штаммов в первичных и перевиваемых культурах клетокDetermination of reproductive properties of virulent and vaccine classical swine fever virus strains in primary and continuous cell cultureshttps://orcid.org/0000-0003-4692-1297КолбинИ. С.KolbinI. S.

Колбин Иван Сергеевич - аспирант, ведущий биолог референтной лаборатории по африканской чуме свиней ВНИИЗЖ.

600901, Владимир,  мкр. Юрьевец.

Ivan S. Kolbin - Post-Graduate Student, Leading Biologist, Reference Laboratory for African Swine Fever ARRIAH.

600901, Vladimir, Yur’evets.

kolbin@arriah.ruhttps://orcid.org/0000-0002-5438-8026ИголкинА. С.IgolkinA. S.

Иголкин Алексей Сергеевич - кандидат ветеринарных  наук, заведующий референтной лабораторией по африканской чуме свиней ВНИИЗЖ.

Владимир.

Alexey S. Igolkin - Candidate of Science (Veterinary Medicine), Head  of  Reference  Laboratory   for  African  Swine   Fever, ARRIAH.

Vladimir.

igolkin_as@arriah.ruhttps://orcid.org/0000-0001-5843-2779ГавриловаВ. Л.GavrilovaV. L.

Гаврилова  Вера Львовна - кандидат биологических  наук, научный сотрудник референтной лаборатории по африканской чуме свиней ВНИИЗЖ.

Владимир.

Vera L. Gavrilova - Candidate of Science (Biology), Researcher, Reference Laboratory  for African Swine Fever, ARRIAH.

Vladimir.

gavrilova_vl@arriah.ruhttps://orcid.org/0000-0003-1584-3169ПузанковаО. С.PuzankovaO. S.

Пузанкова  Ольга Сергеевна - кандидат ветеринарных  наук, старший  научный сотрудник  референтной  лаборатории  по африканской чуме свиней ВНИИЗЖ.

Владимир.

Olga S. Puzankova - Candidate of Science (Veterinary Medicine), Senior Researcher, Reference Laboratory for African Swine Fever, ARRIAH.

Vladimir.

puzankova@arriah.ruhttps://orcid.org/0000-0002-2072-6701АроноваЕ. В.AronovaYe. V.

Аронова Елена Владимировна - кандидат биологических наук, старший научный сотрудник референтной лаборатории по африканской  чуме свиней ВНИИЗЖ.

Владимир.

Yelena V. Aronova - Candidate  of Science  (Biology), Senior Researcher,  Reference  Laboratory  for  African  Swine  Fever, ARRIAH.

Vladimir.

aronova@arriah.ruhttps://orcid.org/0000-0003-4524-4941ЕлсуковаА. А.YelsukovaA. A.

Елсукова Александра Андреевна - кандидат биологических наук, научный сотрудник референтной лаборатории по африканской чуме свиней ВНИИЗЖ.

Владимир.

Alexandra  А. Yelsukova - Candidate  of  Science  (Biology), Researcher,  Reference  Laboratory  for  African  Swine  Fever, ARRIAH.

Vladimir.

elsukova@arriah.ruhttps://orcid.org/0000-0001-8707-7710ВласоваН. Н.VlasovaN. N.

Власова Наталья Никифоровна - доктор биологических наук, главный научный сотрудник  референтной  лаборатории  по африканской чуме свиней ВНИИЗЖ.

Владимир.

Natalia N. Vlasova - Doctor of Science (Biology), Chief Researcher, Reference Laboratory  for African Swine Fever, ARRIAH.

Vladimir.

vlasova_nn@arriah.ruФедеральный центр охраны здоровья животныхРоссияFederal Centre for Animal HealthRussian Federation202210062022112149155Copyright © Колбин И.С., Иголкин А.С., Гаврилова В.Л., Пузанкова О.С., Аронова Е.В., Елсукова А.А., Власова Н.Н., 20222022Колбин И.С., Иголкин А.С., Гаврилова В.Л., Пузанкова О.С., Аронова Е.В., Елсукова А.А., Власова Н.Н.Kolbin I.S., Igolkin A.S., Gavrilova V.L., Puzankova O.S., Aronova Y.V., Yelsukova A.A., Vlasova N.N.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://veterinary.arriah.ru/jour/article/view/643

Классическая чума свиней относится к особо опасным болезням этого вида животных, вспышки которой ежегодно нотифицируют в ряде стран. Несмотря на наличие средств специфической профилактики, опасность распространения заболевания в отдельной стране или во всем мире в целом сохраняется до сих пор. В связи с этим применение высокочувствительных методов ранней диагностики инфекции и определение наличия циркуляции вируса в природе являются необходимыми при надзоре и эрадикации данной болезни. Разработка новейших методов диагностики опирается на хорошо разработанную систему культивирования вируса, поэтому повышение уровня репродукции вируса классической чумы свиней, изучение возможности использования новых, лишенных эндогенной контаминации линий клеток до сих пор остается весьма актуальной задачей. Данная работа посвящена изучению чувствительности первичных и перевиваемых культур клеток к вирусу классической чумы свиней (вакцинных штаммов и ряда полевых изолятов, выделенных на территории России) с детекцией динамики его репродукции при помощи полимеразной цепной реакции с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме реального времени. Также проведен анализ интенсивности репродукции вируса в первичных и перевиваемых  культурах клеток, при этом установлено, что вирус классической чумы свиней не обладает способностью к размножению  в некоторых из них без предварительной адаптации. Показано, что для накопления вируса как полевых изолятов, так и вакцинных штаммов целесообразно применять первичные культуры клеток тестикул свиньи и тестикул ягнят при добавлении в питательную среду 10%-й нормальной серонегативной к вирусу классической чумы свиней сыворотки свиньи, а не фетальной бычьей сыворотки. Определены параметры культивирования и оптимальный состав поддерживающих питательных сред, использование которых способствует увеличению накопления вируса в 4–10 раз как в первичных, так и в перевиваемых культурах клеток.

Classical swine  fever  (CSF) is a highly dangerous porcine disease. CSF outbreaks are annually notified in several countries. Despite the availability of specific prevention tools, the disease spread risk still persists both at country level and at world level. Hence, the disease surveillance and eradication require highly sensitive methods for early diagnosis of the infection and for tests for the virus circulation in the environment.  Development of up-to-date  diagnostic methods is based on well-established  virus cultivation system; therefore, CSF virus reproduction enhancement,  tests of new cell lines without  endogenous  contamination  for their possible use are still of current importance. The said study was aimed at testing of primary and continuous cell cultures for their susceptibility to classical swine fever virus (vaccine virus strains and some field virus isolates recovered in the Russian Federation) and detection of the virus reproduction dynamics with real-time polymerase chain reaction with fluorescent hybridization probes used for detection. Virus replication intensity in primary and continuous cell cultures was also analyzed. The CSF virus was found incapable of replicating in some cell cultures without  its preliminary adaptation.  Primary porcine and lamb testicle cell cultures grown in minimal essential medium supplemented  with 10% normal CSFV-negative porcine serum instead  of fetal bovine serum were shown to be useful for the virus accumulation, both for vaccine strains and field isolates. Cultivation parameters and optimal minimal essential medium composition contributing to the 4–10-fold  increase in the virus accumulation  both in primary and continuous  cell cultures were determined.

классическая чума свинейизоляты вируса классической чумы свинейвакцинные штаммыкультуры клетокобратно-транскриптазная полимеразная цепная реакция с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме реального времениреакция прямой иммунофлуоресценцииclassical swine fever (CSF)CSF virus isolatesvaccine virus strainscell culturesreal-time reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) with fluorescent hybridization probes used for detectiondirect immunofluorescence testАвторы выражают глубокую благодарность сотрудникам сектора культур клеток отдела инноваций ФГБУ «ВНИИЗЖ»: ведущему научному сотруднику Е.Г. Кузнецовой, ведущему технологу Е.А. Трофимовой и ведущему ветеринарному врачу Н.А. Колчанову. Исследование выполнено за счет средств федерального бюджета в рамках проведения научно-исследовательских работ по теме «Ветеринарное благополучие».The authors express their deep gratitude to the staff-members of the Cell Culture Unit of the FGBI “ARRIAH” Innovation Department: Ye.G. Kuznetsova (Leading Researcher), Ye.A. Trofimova (Leading Technologist) and N.A. Kolchanov (Leading Veterinarian). The study was funded by the federal budget as a part of the research activities “Animal Health and Welfare”.ReferencesЖестерев В. И., Балышева В. И., Чурбанова Г. Н., Устаров Р. Д., Зуев В. В. Изучение некоторых биологических свойств вируса КЧС. Актуальные вопросы ветеринарной вирусологии: материалы научно-практической конференции ВНИИВВиМ «Классическая чума свиней– неотложные проблемы науки и практики» (9–11 ноября 1994 г.). Покров; 1995; 14–15. eLIBRARY ID: 20845304.Gesterev V. I., Balysheva V. I., Churbanova G. N., Ustarov R. D., Zuev V. V. Izuchenie nekotorykh biologicheskikh svoistv virusa KChS = Study of some CSF biological properties. Aktual’nye voprosy veterinarnoi virusologii: materialy nauchno-prakticheskoi konferentsii VNIIVViM «Klassicheskaya chuma svinei – neotlozhnye problemy nauki i praktiki» (9–11 noyabrya 1994 g.) = Current aspects of veterinary virology: Proceedings of the Scientific and Practical Conference held at the All-Russia Research Institute for Veterinary Virology and Microbiology: “Classical swine fever – urgent scientific and practical challenges” (November 9–11, 1994). Pokrov; 1995; 14–15. eLIBRARY ID: 20845304. (in Russ.)Барышников П. И. Ветеринарная вирусология: учебное пособие. Барнаул: Изд-во АГАУ; 2006. 113 c.Baryshnikov P. I. Veterinary virology: study guide. Barnaul: ASAU Publishing House; 2006. 113 p. (in Russ.)Крупальник В. Л., Наврузшоева Г. Ш. Классическая и африканская чума свиней: Лекция. М.: ФГОУ ВПО МГАВМиБ им. К. И. Скрябина; 2012. 37 c.Krupalnik V. L., Navruzshoeva G. S. Classical and African swine fever: Lecture. Moscow: Moscow SAVMB; 2012. 37 p. (in Russ.)Федорова А. А., Корпусова Т. И., Петрова О. Н., Решетников Г. Г., Ковалишин В. Ф., Пронин И. А. и др. Иммунобиологические свойства культурального штамма вируса классической чумы свиней. Проблемы мониторинга и генодиагностики инфекционных болезней животных: материалы Международной научной конференции молодых ученых (24–26 марта 2004 г.). Владимир: ФГУ «ВНИИЗЖ»; 2004; 100–101.Fedorova A. A., Korpusova T. I., Petrova O. N., Reshetnikov G. G., Kovalishin V. F., Pronin I. A., et al. Immunobiologicheskie svoistva kul’tural’nogo shtamma virusa klassicheskoi chumy svinei = Immunobiological properties of culture classical swine fever virus strain. Problemy monitoringa i genodiagnostiki infektsionnykh boleznei zhivotnykh: materialy Mezhdunarodnoi nauchnoi konferentsii molodykh uchenykh (24–26 marta 2004 g.) =Problems of monitoring and genodiagnostics of infectious animal diseases: proceedings of the International Scientific Conference of Young Scientists (March 24–26, 2004). Vladimir: FGI “ARRIAH”; 2004; 100–101. (in Russ.)Бабкин Н. В. Использование метода флуоресцирующих антител для определения чувствительности культур клеток к вирусу КЧС. Ветеринарна медицина. Харьков; 2005; 85: 50–52.Babkin N. V. Ispol’zovanie metoda fluorestsiruyushchikh antitel dlya opredeleniya chuvstvitel’nosti kul’tur kletok k virusu KChS = Use of fluorescent antibody technique for testing cell cultures for their sensitivity to CSF virus. Veterinary Medicine. Kharkiv; 2005; 85: 50–52. (in Russ.)Вишняков И. Ф., Митин Н. И., Карпов Г. М., Куриннов В. В., Яшин А. Т. Диагностика и дифференциальная диагностика африканской и классической чумы свиней. Ветеринария. 1991; 4: 28–31. eLIBRARY ID: 18836843.Vishnyakov I. F., Mitin N. I., Karpov G. M., Kurinnov V. V., Yashin A. T. Diagnostika i differentsial’naya diagnostika afrikanskoi i klassicheskoi chumy svinei = African and classical swine fever diagnosis and differential diagnosis. Veterinariya. 1991; 4: 28–31. eLIBRARY ID: 18836843. (in Russ.)Егорова А. И., Толокнов А. С., Филина А. Ю., Окулова О. Н. Выявление вируса КЧС в полевых материалах методом реакции иммунофлюоресценции (РИФ) в перевиваемых гибридных клетках. Проблемы инфекционной патологии сельскохозяйственных животных: тезисы докладов конференции, посвященной 100-летию открытия вируса ящура (27–31 октября 1997 г.). Владимир; ВНИИЗЖ; 1997; 118.Egorova A. I., Toloknov A. S., Filina A. Yu., Okulova O. N. Vyyavlenie virusa KChS v polevykh materialakh metodom reaktsii immunoflyuorestsentsii (RIF) v perevivaemykh gibridnykh kletkakh =Detection of CSF virus in field samples with immunofluorescence test (IFT) in continuous hybrid cells. Problemy infektsionnoi patologii sel’skokhozyaistvennykh zhivotnykh: tezisy dokladov konferentsii, posvyashchennoi 100-letiyu otkrytiya virusa yashchura (27–31 oktyabrya 1997 g.) =Aspects of infectious pathology in livestock animals: Abstracts of the Conference dedicated to the 100 anniversary of FMD virus discovery (October 27–31, 1997). Vladimir; ARRIAH; 1997; 118. (in Russ.)Безбородова С. В., Дрыгин В. В., Перевозчикова Н. А. Повышение чувствительности и специфичности метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) для выявления вируса классической чумы свиней (КЧС). Вирусные болезни сельскохозяйственных животных: тезисы докладов Всероссийской научно-практической конференции (17–23 апреля 1995 г.). Владимир: ВНИИЗЖ; 1995; 15.Bezborodova S. V., Drygin V. V., Perevozchikova N. A. Povyshenie chuvstvitel’nosti i spetsifichnosti metoda polimeraznoi tsepnoi reaktsii (PTsR) dlya vyyavleniya virusa klassicheskoi chumy svinei (KChS) = Improved sensitivity and specificity of the polymerase chain reaction (PCR) for detection of classical swine fever virus. Virusnye bolezni sel’skokhozyaistvennykh zhivotnykh: tezisy dokladov Vserossiiskoi nauchno-prakticheskoi konferentsii (17–23 aprelya 1995 g.) = Viral diseases of livestock animals: abstracts of the All-Russia Scientific andPractical Conference(April 17–23, 1995).Vladimir; ARRIAH; 1995; 15. (in Russ.)Gallei A., Rümenapf T., Thiel H. J., Becher P. Characterization of helper virus-independent cytopathogenic classical swine fever virus generated by an in vivo RNA recombination system. J. Virol. 2005; 79 (4): 2440–2448. DOI: 10.1128/JVI.79.4.2440-2448.2005.Gallei A., Rümenapf T., Thiel H. J., Becher P. Characterization of helper virus-independent cytopathogenic classical swine fever virus generated by an in vivo RNA recombination system. J. Virol. 2005; 79 (4): 2440–2448. DOI: 10.1128/JVI.79.4.2440-2448.2005.Филина А. Ю., Герасимов В. Н., Байбиков Т. З., Егорова А. И. Культивирование различных штаммов вируса классической чумы свиней в перевиваемых культурах клеток. Труды Федерального центра охраны здоровья животных. 2007; 5: 278–284. eLIBRARY ID: 14454067.Filina A. Yu., Gerasimov V. N., Baibikov T. Z., Yegorova A. I. Cultivation of different classical swine fever virus strains in continuous cell cultures. Proceedings of the Federal Centre for Animal Health. 2007; 5: 278–284. eLIBRARY ID: 14454067. (in Russ.)Сергеев В. А., Орлянкин Б. Г., Алексеев К. П., Забережный А. Д., Алипер Т. И., Непоклонов Е. А. Вакцины и стратегия вакцинации против классической чумы свиней. Ветеринария. 2018; 4: 3–11. eLIBRARY ID: 32825056.Sergeyev V. A., Orlyankin B. G., Alekseyev K. P., Zaberezhny A. D., Aliper T. I., Nepoklonov E. A. Vaccines and vaccination strategies against classical swine fever. Veterinariya. 2018; 4: 3–11. eLIBRARY ID: 32825056. (in Russ.)Гребенникова Т. В., Забережный А. Д., Алипер Т. И., Непоклонов Е. А. Генетическая характеристика вакцинного штамма КС вируса классической чумы свиней: сравнительный анализ первичной последовательности генов поверхностных гликопротеинов Erns, E1, E2. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 1999; 2: 34–40. eLIBRARY ID: 21818654.Grebennikova T. V., Zaberezhny A. D., Aliper T. I., Nepoklonov E. A. Geneticheskaya kharakteristika vaktsinnogo shtamma KS virusa klassicheskoi chumy svinei: sravnitel’nyi analiz pervichnoi posledovatel’nosti genov poverkhnostnykh glikoproteinov Erns, E1, E2 = Genetic characterization of KS strain of classical swine fever virus: comparative analysis of primary sequences of Erns, E1, E2 surface glycoprotein genes. Molecular Genetics, Microbiology and Virology. 1999; 2: 34–40. eLIBRARY ID: 21818654. (in Russ.)Raut S. D., Rajak K. K., Kumar R., Singh V. K., Saxena A., Chaudhary D., et al. Characterization of cytopathogenicity of classical swine fever virus isolate induced by Newcastle disease virus. Virus Disease. 2015; 26 (1-2): 70–76. DOI: 10.1007/s13337-015-0253-0.Raut S. D., Rajak K. K., Kumar R., Singh V. K., Saxena A., Chaudhary D., et al. Characterization of cytopathogenicity of classical swine fever virus isolate induced by Newcastle disease virus. Virus Disease. 2015; 26 (1-2): 70–76. DOI: 10.1007/s13337-015-0253-0.Zhang H., Leng C., Feng L., Zhai H., Chen J., Liu C., et al. A new subgenotype 2.1d isolates of classical swine fever virus in China, 2014. Infect. Genet. Evol. 2015; 34: 94–105. DOI: 10.1016/j.meegid.2015.05.031.Zhang H., Leng C., Feng L., Zhai H., Chen J., Liu C., et al. A new subgenotype 2.1d isolates of classical swine fever virus in China, 2014. Infect. Genet. Evol. 2015; 34: 94–105. DOI: 10.1016/j.meegid.2015.05.031.Коломыцев А. А., Миколайчук С. В. Анализ выполнения мероприятий по борьбе с классической чумой свиней, принятых на всесоюзном и всероссийском уровнях, разрабатываемых ВНИИВВИМ. Актуальные вопросы ветеринарной вирусологии: материалы научно-практической конференции ВНИИВВиМ «Классическая чума свиней – неотложные проблемы науки и практики» (9–11 ноября 1994 г.). Покров; 1995; 107–108. eLIBRARY ID: 20844475.Kolomytsev A. A., Mikolaichuk S. V. Analiz vypolneniya meropriyatii po bor’be s klassicheskoi chumoi svinei, prinyatykh na vsesoyuznom i vserossiiskom urovnyakh, razrabatyvaemykh VNIIVVIM = Analysis of implementation of the measures for classical swine fever control developed by the All-Russia Research Institute for Veterinary Virology and Microbiology adopted at all-USSR and all-Russian Federation levels. Aktual’nye voprosy veterinarnoi virusologii: materialy nauchno-prakticheskoi konferentsii VNIIVViM «Klassicheskaya chuma svinei – neotlozhnye problemy nauki i praktiki» (9–11 noyabrya 1994 g.) = Current aspects of veterinary virology: Proceedings of the Scientific and Practical Conference held at the All-Russia Research Institute for Veterinary Virology and Microbiology: “Classical swine fever – urgent scientific and practical challenges” (November 9–11, 1994). Pokrov; 1995; 107–108. eLIBRARY ID: 20844475. (in Russ.)Перзашкевич В. С., Кадетов В. В., Цыбанов С. Ж., Куриннов В. В., Балышева В. И. Очистка вируса классической чумы свиней. Актуальные вопросы ветеринарной вирусологии: материалы научно-практической конференции ВНИИВВиМ «Классическая чума свиней – неотложные проблемы науки и практики» (9–11 ноября 1994 г.). Покров; 1995; 20–21. eLIBRARY ID: 20849169.Perzashkevich V. S., Kadetov V. V., Tsybanov S. Zh., Kurinnov V. V., Balysheva V. I. Ochistka virusa klassicheskoi chumy svinei = Purification of classical swine fever virus. Aktual’nye voprosy veterinarnoi virusologii: materialy nauchno-prakticheskoi konferentsii VNIIVViM «Klassicheskaya chuma svinei – neotlozhnye problemy nauki i praktiki» (9–11 noyabrya 1994 g.) = Current aspects of veterinary virology: Proceedings of the Scientific and Practical Conference at the All-Russia Research Institute for VeterinaryVirology and Microbiology: “Classical swine fever – urgent scientific and practical challenges” (November 9–11, 1994). Pokrov; 1995; 20–21. eLIBRARY ID: 20849169. (in Russ.)Методические указания по выделению вируса классической чумы свиней на различных культурах клеток с идентификацией возбудителя в реакции иммунофлюоресценции: утв. Россельхознадзором 13.09.2017 МУ 19-17. Владимир: ФГБУ «ВНИИЗЖ»; 2017. 21 с.Methodical Guidelines for classical swine fever virus isolation in different cell cultures followed by the virus identification with immunofluorescence test: approved by the Rosselkhoznadzor on 13 September 2017, MG 19-17. Vladimir: FGBI”ARRIAH”; 2017. 21 p. (in Russ.)Колбин И. С., Власова Н. Н., Иголкин А. С., Елсукова А. А., Гаврилова В. Л., Пузанкова О. С. Методические рекомендации по выделению вируса классической чумы свиней на первичных культурах клеток (СС, КМС, СП, ТЯ, ТС) с идентификацией возбудителя методом полимеразной цепной реакции с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме реального времени: утв. ФГБУ «ВНИИЗЖ» 14.09.2021 № 42-21. Владимир: ФГБУ «ВНИИЗЖ»; 2021. 56 с.Kolbin I. S., Vlasova N. N., Igolkin A. S., Elsukova A. A., Gavrilova V. L., Puzankova O. S. Methodical Guidelines for classical swine fever virus isolation in primary cell cultures (PS, PBM, PK, PT, LT) followed by the virus identification with real-time polymerase chain reaction including detection using fluorescent hybridization probes: approved by the FGBI “ARRIAH” on 14 September 2021, No. 42-21. Vladimir: FGBI ”ARRIAH”; 2021. 56 р. (in Russ.)Инструкция по применению тест-системы «КЧС» для выявления возбудителя классической чумы свиней методом полимеразной цепной реакции с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме реального времени: утв. 26.10.2020. М.: ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора. 2020. 25 с.Instruction on use of CSF test kit for detection of classical swine fever agent with real-time polymerase chain reaction including detection using fluorescent hybridization probes: approved on 26 October 2020. Мoscow: Federal Budgetary Scientific Institution “Central Research Institute of Epidemiology” of the Federal Service for Surveillance on Consumer Rights Protection and Human Wellbeing. 2020. 25 p. (in Russ.)

The authors declare that there are no conflicts of interest present.