veterinaryВетеринария сегодняVeterinary Science Today2304-196X2658-6959"Veinard"10.29326/2304-196X-2021-3-38-230-238veterinary-576Research ArticleБИОТЕХНОЛОГИЯBIOTECHNOLOGYИсследование биологических свойств перевиваемой суспензионной линии клеток ВНК-21/SUSP/ARRIAHStudies of biological properties of continuous suspension ВНК-21/SUSP/ARRIAH cell linehttps://orcid.org/0000-0002-4682-6559ДоронинМ. И.DoroninM. I.

Доронин Максим Игоревич, кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник лаборатории профилактики ящура

600901, Владимир, мкр. Юрьевец

Maksim I. Doronin, Candidate of Science (Biology), Leading Researcher, Laboratory for FMD Prevention

600901, Vladimir, Yur’evets

doronin@arriah.ruhttps://orcid.org/0000-0002-3997-3390ГусеваМ. Н.GusevaM. N.

Гусева Марина Николаевна, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник лаборатории профилактики ящура 

Владимир

Marina  N.  Guseva, Candidate of Science (Biology), Senior Researcher, Laboratory for FMD Prevention

Vladimir

guseva_mn@arriah.ruhttps://orcid.org/0000-0003-1718-1955МихалишинД. В.MikhalishinD. V.

Михалишин Дмитрий Валерьевич, кандидат ветеринарных наук, заведующий лабораторией профилактики ящура

Владимир

Dmitry V. Mikhalishin, Candidate of Science (Veterinary Medicine), Head of Laboratory for FMD Prevention

Vladimir

mihalishindv@arriah.ruhttps://orcid.org/0000-0002-1479-5479ШарыповА. С.SharypovA. S.

Шарыпов Андрей Сергеевич, кандидат ветеринарных наук, научный сотрудник отдела координации научно-исследовательских работ

Москва

Andrey S. Sharypov, Candidate of Science (Veterinary Medicine), Researcher, Department for Research Coordination

Moscow

science@cnmvl.ruhttps://orcid.org/0000-0002-9788-9197МудракН. С.MudrakN. S.

Мудрак Наталья Станиславовна, доктор биологических наук, главный научный сотрудник референтной лаборатории вирусных болезней птиц

Владимир

Natalia S. Mudrak, Doctor of Science (Biology), Chief Researcher, Reference Laboratory for Avian Viral Diseases

Vladimir

mudrak@arriah.ruhttps://orcid.org/0000-0001-5671-2347КамаловаН. Е.KamalovaN. Ye.

Камалова Наталья Евгеньевна, доктор ветеринарных наук, главный научный сотрудник центра доклинических исследований

Владимир

Natalia Ye. Kamalova, Doctor of Science (Veterinary Medicine), Chief Researcher, Centre for Preclinical Studies

Vladimir

kamalova@arriah.ruhttps://orcid.org/0000-0002-5263-1491МанинБ. Л.ManinB. L.

Манин Борис Леонидович, кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник сектора культуры клеток отдела инноваций

Владимир

Boris L. Manin, Candidate of Science (Biology), Leading Researcher, Sector for Cell Culture, Innovation Department

Vladimir

manin_bl@arriah.ruФГБУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» (ФГБУ «ВНИИЗЖ»)РоссияFGBI “Federal Centre for Animal Health” (FGBI “ARRIAH”)Russian FederationФГБУ «Центральная научно-методическая ветеринарная лаборатория» (ФГБУ ЦНМВЛ)РоссияFSBI “Central Scientific and Methodological Veterinary Laboratory” (FSBI CNMVL)Russian Federation202116082021103230238Copyright © Доронин М.И., Гусева М.Н., Михалишин Д.В., Шарыпов А.С., Мудрак Н.С., Камалова Н.Е., Манин Б.Л., 20212021Доронин М.И., Гусева М.Н., Михалишин Д.В., Шарыпов А.С., Мудрак Н.С., Камалова Н.Е., Манин Б.Л.Doronin M.I., Guseva M.N., Mikhalishin D.V., Sharypov A.S., Mudrak N.S., Kamalova N.Y., Manin B.L.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://veterinary.arriah.ru/jour/article/view/576

Представлены результаты изучения цитоморфологических, кариологических, культуральных характеристик перевиваемой суспензионной клеточной сублинии из почки новорожденного сирийского хомячка ВНК-21/SUSP/ARRIAH, предназначенной для репродукции вирусов ящура, бешенства, парагриппа-3 крупного рогатого скота, болезни Ауески, а также для изготовления диагностических ветеринарных биопрепаратов. Сублиния клеток BHK-21/SUSP/ARRIAH при суспензионном культивировании проходит селекцию в направлении гипоплоидии: модальный класс соответствует 41 хромосоме (32–40% клеток); доля клеток с количеством хромосом 40–42 составляет 78–80%; доля полиплоидов – в среднем около 1%; пределы изменчивости хромосомного набора соответствуют диапазону от 36 до 54 хромосом. Клеточная сублиния BHK-21/SUSP/ARRIAH при суспензионном культивировании с посевной концентрацией 0,6–0,8 млн кл./см3 имеет кратность прироста 6,67–11,00 при жизнеспособности клеток 96–99%. В клеточном цикле популяции новой сублинии через 48 ч преобладает G1-фаза (диплоидная-2n), на которую приходится 30,0–75,0% клеток; в фазах подготовки к митозу (S-фаза) и митотического деления (G2+M-фаза) находится от 3,0 до 20,0% всей популяции; количество крупноядерных и многоядерных клеток (>4n) в начале и конце стадии логарифмического роста увеличивается до 2%. Клетки сублинии BHK-21/SUSP/ARRIAH быстро восстанавливаются после криоконсервирования с жизнеспособностью 95–99% и кратностью прироста 3,36–5,88 на первом – третьем пассажах и 6,85–10,95 – с четвертого по двенадцатый пассаж. Перевиваемая суспензионная линия клеток BHK-21/SUSP/ARRIAH обеспечивает накопление вируса ящура в титрах 7,30–8,00 lg ТЦД50/см3, вируса бешенства – 7,25–8,00 lg ККИД50/см3, вируса парагриппа-3 крупного рогатого скота в титрах не менее 6,00 lg ТЦД50/см3, вируса болезни Ауески – 7,50–7,80 lg ТЦД50/см3.

 

The results of the studies of cytomorphological, karyological, cultural properties of continuous suspension ВНК-21/SUSP/ARRIAH subline of newborn Syrian hamster kidney cells intended for foot-and-mouth disease, rabies, bovine parainfluenza-3, Aujeszky’s disease virus reproduction, as well as for production of diagnostic veterinary biologicals are presented. When cultured in suspension, BHK-21/SUSP/ARRIAH cell subline undergoes selection towards hypoploidy: modal class is represented by cells with 41 chromosomes (32–40% of cells); the share of cells containing 40–42 chromosomes is 78–80%; the share of polyploids averages around 1%; the range of variation in the number of chromosomes is from 36 to 54. BHK-21/SUSP/ARRIAH cell subline cultured in suspension with cell seeding concentration of 0.6–0.8 million cells/cm3 demonstrates growth rate of 6.67–11.00 and 96–99% cell viability. After 48 hours, G1-phase (diploid-2n) cells prevail in the cell population of the new subline (30.0–75.0% of cells); cells that undergo preparation for mitosis (S-phase) and mitosis (G2+M-phase) account for 3.0 to 20.0% of the entire population; the number of meganucleated and multinucleated cells (>4n) at the beginning and at the end of the logarithmic phase increases to 2%. BHK-21/SUSP/ARRIAH cells recover rapidly after cryopreservation and demonstrate 95–99% viability and growth rate of 3.36–5.88 at passages 1 to 3 and 6.85–10.95 at passages 4 to 12. Continuous suspension BHK-21/SUSP/ARRIAH cell line ensures virus accumulation at the following titres: FMD virus – 7.30– 8.00 lg TCID50/cm3, rabies virus – 7.25–8.00 lg CCID50/cm3, bovine parainflunza-3 virus – at least 6.00 lg TCID50/cm3, Aujeszky’s disease virus – 7.50–7.80 lg TCID50/cm3.

клеточная линия ВНК-21/SUSP/ARRIAHбиологические свойства культуры клетокящурбешенствопарагрипп-3 крупного рогатого скотаболезнь АуескиВНК-21/SUSP/ARRIAH cell linebiological properties of cell culturefoot-and-mouth diseaserabiesbovine parainflunza-3Aujeszky’s diseaseРабота выполнена за счет средств ФГБУ «ВНИИЗЖ» в рамках тематики научно-исследовательских работ «Ветеринарное благополучие».The study was funded by the FGBI “ARRIAH” within the framework of “Veterinary Welfare” research work.ReferencesStoker M., Macpherson I. Syrian hamster fibroblast cell line BHK-21 and its Derivatives. Nature. 1964; 203: 1355–1357. DOI: 10.1038/2031355A0.Stoker M., Macpherson I. Syrian hamster fibroblast cell line BHK-21 and its Derivatives. Nature. 1964; 203: 1355–1357. DOI: 10.1038/2031355A0.Манин Б. Л., Михалишин В. В., Корпусова Т. И., Стегний Б. Т., Лаврик А. А. Параметры биологической толерантности производственной клеточной культуры ВНК-21. Ветеринарна медицина: міжвід. темат. наук. зб. Харкiв; 2002; 80: 404–408.Manin B. L., Mikhalishin V. V., Korpusova T. I., Stegniy B. T., Lavrik A. A. Biological tolerance parameters of production ВНК-21 cell culture [Parametry biologicheskoj tolerantnosti proizvodstvennoj kletochnoj kul’tury BHK-21]. Veterinary Medicine: Inter-Departmental Subject Scientific Collection. Kharkiv; 2002; 80: 404–408. (in Russian).Сокова В. В., Алиева Л. А., Бондаренко А. Ф., Худяков Г. А. Клеточная линия почки новорожденного сирийского хомячка ВНК-21/2-17b. Авторское свидетельство № 240289 СССР. ВНИЯИ; 1986.Sokova V. V., Aliyeva L. А., Bondarenko A. F., Khudyakov G. A. ВНК-21/ 2-17b line of newborn Syrian hamster kidney cells [Kletochnaya liniya pochki novorozhdennogo sirijskogo homyachka BHK-21/2-17b]. Certificate of Authorship No. 240289 USSR. All-Union Foot-and-Mouth Disease Research Institute; 1986. (in Russian).Елисеев А. К., Мельник Н. В., Зенов Н. И., Литенкова И. Ю., Богач В. Н., Иванов В. С. и др. ВНК-21/13-02-перевиваемая монослойно-суспензионная сублиния клеток почки новорожденного сирийского хомячка, предназначенная для репродукции вируса ящура и вируса бешенства. Патент № 2614074 Российская Федерация, МПК C12N 5/07 (2010.01). ФКП «Щелковский биокомбинат». № 2005116301. Заявл. 31.05.2005. Опубл. 22.03.2017. Бюл. № 9.Eliseev A. K., Melnik N. V., Zenov N. I., Litenkova I. Yu., Bogach V. N., Ivanov V. S., et al. BHK-21/13-02-transplantable monolayer-suspension subline of newborn syrian hamster kidney cells, intended for FMD virus and rabies virus reproduction. Patent No. 2614074 Russian Federation, Int. C12N 5/07 (2010.01). FKP “Shchelkovskij biokombinat”. No. 2005116301. Date of filing: 31.05.2005. Date of publication: 22.03.2017. Bull. No. 9. (in Russian).Елисеев А. К., Зенов Н. И., Красуткин С. Н., Мельник Н. В., Хайкина Л. С., Литенкова И. Ю. и др. ВНК-21/13-13-перевиваемая монослойно-суспензионная сублиния клеток почки новорожденного сирийского хомячка, предназначенная для репродукции вируса ящура и вируса бешенства. Патент № 2553552 Российская Федерация, МПК C12N 5/071 (2010.01). ФКП «Щелковский биокомбинат». № 2014131866/10. Заявл. 01.08.2014. Опубл. 20.06.2015. Бюл. № 17.Eliseev A. K., Zenov N. I., Krasutkin S. N., Mel’nik N. V., Khajkina L. S., Litenkova I. Yu., et al. BHK-21/13-13-finite monolayer-suspension cell subline of kidney of new-born syrian hamster, intended for reproduction of foot-and-mouth disease virus and rabies virus. Patent No. 2553552 Russian Federation, Int. C12N 5/071 (2010.01). FKP “Shchelkovskij biokombinat”. No. 2014131866/10. Date of filing: 01.08.2014. Date of publication: 20.06.2015. Bull. No. 17. (in Russian).Российская коллекция клеточных культур (РККК): каталог. Под ред. Г. П. Пинаева, Г. Г. Полянской. СПб.; 2004. 315 с.Russian Cell Culture Collection (RCCC) [Rossijskaya kollekciya kletochnyh kul’tur (RKKK)]: catalogue. Ed. by G. P. Pinayev, G. G. Polyanskaya. St. Petersburg; 2004. 315 p. (in Russian).Бейли Дж., Оллис Д. Основы биохимической инженерии. Пер. с англ. в 2-х частях. Ч. 1. М.: Мир; 1989. 692 с.Bailey J. E., Ollis D. F. Biochemical Engineering Fundamentals. 2nd ed. New Delhi: McGraw-Hill, Inc.; 1986. 984 p.Методы культивирования клеток: сборник научных трудов АН СССР. Отв. ред. Г. П. Пинаев. Л.: Наука; 1988. 319 с.Cell culture techniques [Metody kul’tivirovaniya kletok]: Proceedings of the Academy of Sciences of the USSR. Executive ed. G. P. Pinayev. L.: Nauka; 1988. 319 p. (in Russian).Каталог Российской коллекции клеточных культур. Отв. ред. Г. П. Пинаев, Г. Г. Полянская. Омск: ОмГПУ; 1999. 429 с.Catalogue of Russian Cell Culture Collection [Katalog Rossijskoj kollekcii kletochnyh kul’tur]. Executive ed. G. P. Pinayev, G. G. Polyanskaya. Omsk: Omsk State Pedagogical University (OSPU); 1999. 429 p. (in Russian).Юрков С. Г., Зуев В. В., Сидоров С. И., Кушнир С. Д., Смыслова Н. Ю., Неверовская Н. С. и др. Каталог коллекции клеточных культур ВНИИВВиМ. Покров; 2000; 60–62. eLIBRARY ID: 21632428.Yurkov S. G., Zuyev V. V., Sidorov S. I., Kushnir S. D., Smyslova N. Yu., Neverovskaya N. S., et al. Catalogue of Cell Culture Collection of the All-Russian Research Institute of Veterinary Virology and Microbiology (VNIIVViM) [Katalog kollekcii kletochnyh kul’tur VNIIVViM]. Pokrov; 2000; 60–62. eLIBRARY ID: 21632428. (in Russian).Лозовой Д. А., Гусева М. Н., Михалишин Д. В., Доронин М. И., Манин Б. Л., Шишкова А. А. и др. BHK-21/SUSP/ARRIAH – перевиваемая суспензионная сублиния клеток почки новорожденного сирийского хомячка, предназначенная для репродукции вирусов ящура, бешенства, парагриппа-3, болезни Ауески при производстве противовирусных вакцин, а также для изготовления диагностических и профилактических ветеринарных биопрепаратов. Патент № 2722671 Российская Федерация, МПК C12N 5/10 (2006.01). ФГБУ «ВНИИЗЖ». № 2019131190. Заявл. 01.10.2019. Опубл. 02.06.2020. Бюл. № 16.Lozovoy D. A., Guseva M. N., Mikhalishin D. V., Doronin M. I., Manin B. L., Shishkova A. A., et al. BHK-21/SUSP/ARRIAH – continuous suspension subline of newborn syrian hamster kidney cells, intended for reproduction of foot-and-mouth disease viruses, rabies, parainfluenza- 3, Aujeszky’s disease in producing antiviral vaccines, as well as for making diagnostic and preventive veterinary biopreparations. Patent No. 2722671 Russian Federation, Int. C12N 5/10 (2006.01). FGBI “ARRIAH”. No. 2019131190. Date of filing: 01.10.2019. Date of publication: 02.06.2020. Bull. No. 16. (in Russian).Полянская Г. Г. Закономерности кариотипической изменчивости в клеточных культурах при длительном культивировании в разных линиях: автореф. дис. ... д-ра биол. наук. СПб.; 2000. 38 с.Polyanskaya G. G. Karyotype variation patterns in cell cultures during long-term cultivation in different cell lines [Zakonomernosti kariotipicheskoj izmenchivosti v kletochnyh kul’turah pri dlitel’nom kul’tivirovanii v raznyh liniyah]: author’s abstract of Candidate of Science (Biology) thesis. St. Petersburg; 2000. 38 p. (in Russian).Moorhead P. S., Nowell P. C., Mellman W. J., Battips D. M., Hungerford D. A. Chromosome preparations of leukocytes cultured from human peripheral blood. Exp. Cell. Res. 1960; 20: 613–616. DOI: 10.1016/0014-4827(60)90138-5.Moorhead P. S., Nowell P. C., Mellman W. J., Battips D. M., Hungerford D. A.Мамаева С. Е. Хромосомный анализ культивируемых клеток. Методы культивирования клеток. Л.: Наука; 1987; 78–98.Chromosome preparations of leukocytes cultured from human peripheralКудрявцев И. В., Хайдуков С. В., Зурочка А. В., Черешнев В. А. Проточная цитометрия в экспериментальной биологии. Екатеринбург: УрО РАН; 2012. 192 с.blood. Exp. Cell. Res. 1960; 20: 613–616. DOI: 10.1016/0014-4827(60)90138-5.Ormerod M. G., Tribukait B., Giaretti W. Consensus report of the task force on standardisation of DNA flow cytometry in clinical pathology. Analytical Cellular Pathology. 1998; 17 (2): 103–110. DOI: 10.1155/1998/842306.Mamayeva S. Ye. Chromosomal analysis of cultured cells [Hromosomnyj analiz kul’tiviruemyh kletok]. In: Cell culture techniques. L.: Nauka; 1987; 78–98. (in Russian).Rais Y., Zviran A., Geula S., Gafni O., Chomsky E., Viukov S., et al. Deterministic direct reprogramming of somatic cells to pluripotency. Nature. 2013; 502 (7549): 65–70. DOI: 10.1038/nature12587.Kudryavtsev I. V., Khaydukov S. V., Zurochka A. V., Chereshnev V. A. Flow cytometry in experimental biology [Protochnaya citometriya v eksperimental’noj biologii]. Yekaterinburg: Ural Branch of the Russian Academy of Sciences (UB RAS); 2012. 192 p. (in Russian).Ormerod M. G., Tribukait B., Giaretti W. Consensus report of the task force on standardisation of DNA flow cytometry in clinical pathology. Analytical Cellular Pathology. 1998; 17 (2): 103–110. DOI: 10.1155/1998/842306.Ormerod M. G., Tribukait B., Giaretti W. Consensus report of the task force on standardisation of DNA flow cytometry in clinical pathology. Analytical Cellular Pathology. 1998; 17 (2): 103–110. DOI: 10.1155/1998/842306.Rais Y., Zviran A., Geula S., Gafni O., Chomsky E., Viukov S., et al. Deterministic direct reprogramming of somatic cells to pluripotency. Nature. 2013; 502 (7549): 65–70. DOI: 10.1038/nature12587.Rais Y., Zviran A., Geula S., Gafni O., Chomsky E., Viukov S., et al. Deterministic direct reprogramming of somatic cells to pluripotency. Nature. 2013; 502 (7549): 65–70. DOI: 10.1038/nature12587.

The authors declare that there are no conflicts of interest present.