veterinaryВетеринария сегодняVeterinary Science Today2304-196X2658-6959"Veinard"10.29326/2304-196X-2020-3-34-220-227veterinary-505Research ArticleБИОТЕХНОЛОГИЯBIOTECHNOLOGYОпосредованное определение концентрации 146S компонента вируса ящура в неинактивированной суспензии при сравнении графиков второй производной для кривых ОТ-ПЦР-РВIndirect determination of FMDV 146S component concentration in non-inactivated suspension by comparison of graphs of the second derivative for real-time RT-PCR curveshttps://orcid.org/0000-0002-4682-6559ДоронинМ. И.DoroninM. I.

Доронин Максим Игоревич, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник лаборатории профилактики ящура

600901, г. Владимир, мкр. Юрьевец

Maksim I. Doronin, Candidate of Science (Biology), Senior Researcher, Laboratory for FMD Prevention

600901, Vladimir, Yur’evets

doronin@arriah.ruhttps://orcid.org/0000-0003-1718-1955МихалишинД. В.MikhalishinD. V.

Михалишин Дмитрий Валерьевич, кандидат ветеринарных наук, заведующий лабораторией профилактики ящура

г. Владимир

Dmitry V. Mikhalishin, Candidate of Science (Veterinary Medicine), Head of Laboratory for FMD Prevention

Vladimir

mihalishindv@arriah.ruhttps://orcid.org/0000-0002-9960-0887СтариковВ. А.StarikovV. A.

Стариков Вячеслав Алексеевич, кандидат ветеринарных наук, ведущий научный сотрудник лаборатории профилактики ящура

г. Владимир

Vyacheslav A. Starikov, Candidate of Science (Veterinary Medicine), Leading Researcher, Laboratory for FMD Prevention

Vladimir

starikov@arriah.ruhttps://orcid.org/0000-0002-5983-7062ЛозовойД. А.LozovoyD. A.

Лозовой Дмитрий Анатольевич, доктор ветеринарных наук, доцент

г. Владимир

Dmitry A. Lozovoy, Doctor of Science (Veterinary Medicine), Associate Professor

Vladimir

lozovoy@arriah.ruhttps://orcid.org/0000-0001-9880-9657БорисовА. В.BorisovA. V.

Борисов Алексей Валерьевич, кандидат ветеринарных наук, ведущий научный сотрудник лаборатории профилактики ящура

г. Владимир

Alexey V. Borisov, Candidate of Science (Veterinary Medicine), Leading Researcher, Laboratory for FMD Prevention

Vladimir

borisov_av@arriah.ruФГБУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» (ФГБУ «ВНИИЗЖ»)РоссияFGBI “Federal Centre for Animal Health” (FGBI “ARRIAH”)Russian Federation20201609202003220227Copyright © Доронин М.И., Михалишин Д.В., Стариков В.А., Лозовой Д.А., Борисов А.В., 20202020Доронин М.И., Михалишин Д.В., Стариков В.А., Лозовой Д.А., Борисов А.В.Doronin M.I., Mikhalishin D.V., Starikov V.A., Lozovoy D.A., Borisov A.V.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://veterinary.arriah.ru/jour/article/view/505

При репродукции в биологических системах вирус ящура формирует 4 варианта компонентов, три из которых не включают в себя РНК вируса. В процессе промышленного производства противоящурных вакцин особое внимание уделяют количеству цельных вирионов, которые обладают важнейшими биологическими свойствами вируса ящура и являются основными компонентами, определяющими иммуногенность вакцинных препаратов. Сырье для вакцин на различных этапах технологического процесса исследуют с целью определения концентрации 146S компонента вируса ящура. Традиционным методом определения является количественный вариант реакции связывания комплемента. Для опосредованного определения концентрации 146S компонента вируса ящура в вируссодержащей суспензии в последние годы стали использовать полимеразную цепную реакцию с обратной транскрипцией в режиме реального времени. В статье представлен новый подход к опосредованному определению концентрации 146S компонента вируса ящура в неинактивированной суспензии при сравнении максимальных экстремумов графиков второй производной кривых накопления сигнала флуоресценции относительно количества циклов реакции амплификации. Существование зависимости между концентрацией 146S компонента вируса ящура и максимальными экстремумами графиков второй производной кривой накопления флуоресцентного сигнала представлено в виде квадратичной функции С146S ВЯ = 0,0111(Сp)2 – 1,0157Cp + 20,446 с высокой достоверностью аппроксимации (R2 = 0,993). Предложенная модель позволяет количественно оценивать содержание 146S компонента в вируссодержащем сырье для вакцины. Представленный способ позволяет исследовать большое количество образцов неинактивированного сырья для противоящурной вакцины за 4–5 ч. Основным преимуществом предлагаемого способа является возможность определения концентрации 146S компонента вируса ящура в суспензии, содержащей высокое количество балластного белка (более 7,00 мг/см3) и количество полных вирусных частиц от 0,01 до 5,00 мкг/см3.

During reproduction in biological systems, FMD virus forms four variants of components, three of which do not include RNA of the virus. In the process of industrial production of FMD vaccines, special attention is paid to the number of whole virions, which have the most important biological properties of FMD virus and are the main components that determine the immunogenicity of vaccine preparations. Raw materials for vaccines at various stages of the technological process are tested for concentration of FMDV 146S component. The traditional method of determination is quantitative complement fixation test. In recent years, real-time RT-PCR has been used for indirect determination of FMDV 146S component concentration in a virus-containing suspension. The article presents a new approach to indirect determination of FMDV 146S component concentration in a non-inactivated suspension by comparing the maximum extreme points of the graphs of the second derivative of the fluorescence signal accumulation curves and the number of amplification reaction cycles. The dependence between FMDV 146S component concentration and the maximum extreme points of the graphs of the second derivative of the fluorescence signal accumulation curve is presented in the form of a square function: C146S FMDV = 0.0111(Cp)2 – 1.0157Cp + 20.446 with a high accuracy of approximation (R2 = 0.993). The proposed model allows to quantitatively estimate the content of 146S component in virus-containing vaccine raw materials. The presented method allows studying a large number of samples of non-inactivated raw materials for FMD vaccine in 4–5 hours. The main advantage of the proposed method is the capacity to determine the concentration of FMDV 146S component in a suspension with a high level of ballast proteins (more than 7.00 mg/cm3) and complete viral particles (from 0.01 to 5.00 μg/cm3).

вирионы вируса ящураОТ-ПЦР-РВпороговый цикл амплификацииграфик второй производной кривой амплификацииFMDV virionsreal-time RT-PCRamplification threshold cyclegraph of second derivative of amplification curveРабота выполнена за счет средств ФГБУ «ВНИИЗЖ» в рамках тематики научно-исследовательских работ «Ветеринарное благополучие».The study was funded by the FGBI “ARRIAH” within the framework of “Veterinary Welfare” research work.ReferencesLubroth J., Rodriguez L., Dekker A. Vesicular diseases. In: Diseases of Swine. Ed by B. E. Straw, J. J. Zimmerman, S. D’Allaire, D. J. Taylor. 9 th ed. Ames, Iowa, USA: Blackwell Publishing Professional; 2006: 517–536.Lubroth J., Rodriguez L., Dekker A. Vesicular diseases. In: Diseases of Swine. Ed by B. E. Straw, J. J. Zimmerman, S. D’Allaire, D. J. Taylor. 9 th ed. Ames, Iowa, USA: Blackwell Publishing Professional; 2006: 517–536.Foot and mouth disease (infection with foot and mouth disease virus). In: OIE. Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals. 2018; Chap. 3.1.8: 433–464. Available at: https://www.oie.int/fileadmin/Home/eng/Health_standards/tahm/3.01.08_FMD.pdf.Foot and mouth disease (infection with foot and mouth disease virus). In: OIE. Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals. 2018; Chap. 3.1.8: 433–464. Available at: https://www.oie.int/fileadmin/Home/eng/Health_standards/tahm/3.01.08_FMD.pdf.Пономарев А. П., Узюмов В. Л. Вирус ящура: структура, биологические и физико-химические свойства. Владимир: Фолиант; 2006. 250 с.Ponomarev А. P., Uzyumov V. L. Foot-and-mouth disease virus: structure, biological, physical and chemical properties [Virus yashchura: struktura, biologicheskie i fiziko-himicheskie svojstva]. Vladimir: Foliant; 2006: 250 p. (in Russian)Alexandersen S., Zhang Z., Donaldson A. L., Garland A. J. M. The pathogenesis and diagnosis of foot-and-mouth disease. J. Comp. Pathol. 2003; 129 (1): 1–36. DOI: 10.1016/s0021-9975(03)00041-0.Alexandersen S., Zhang Z., Donaldson A. L., Garland A. J. M. The pathogenesis and diagnosis of foot-and-mouth disease. J. Comp. Pathol. 2003; 129 (1): 1–36. DOI: 10.1016/s0021-9975(03)00041-0.Food-and-Mouth Disease Virus. Taxonomy. Available at: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/taxonomy/?term=FMDV.Food-and-Mouth Disease Virus. Taxonomy. Available at: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/taxonomy/?term=FMDV.Бондаренко А. Ф. Качественный и количественный иммунохимический анализ вирусных белков. Суздаль. 1994: 92 с.Bondarenko А. F. Qualitative and quantitative immunochemical assay of viral proteins [Kachestvennyj i kolichestvennyj immunohimicheskij analiz virusnyh belkov]. Suzdal; 1994: 92 p. (in Russian)Лозовой Д. А., Михалишин Д. В., Доронин М. И., Щербаков А. В., Тимина А. М., Шишкова А. A. и др. Способ определения концентрации 146S-компонента вируса ящура в вируссодержащем сырье для вакцины с применением метода обратной транскрипции-полимеразной цепной реакции в режиме реального времени. Патент № 2619878 Российская Федерация, МПК G01N 33/58 (2006.01), C12Q 1/68 (2006.01). ФГБУ «ВНИИЗЖ». № 2016140460. Заявл. 14.10.2016. Опубл. 18.05.2017. Бюл. № 14.Lozovoy D. A., Mikhalishin D. V., Doronin M. I., Shcherbakov A. V., Timina A. M., Shishkova A. A., et al. Method for foot and mouth disease virus 146S-component concentration determination in virus-containing raw material for vaccine using reverse transcription-polymerase chain reaction method in real time mode. Patent No. 2619878 Russian Federation, Int. Cl. G01N 33/58 (2006.01), C12Q 1/68 (2006.01). FGBI “ARRIAH”. No. 2016140460. Date of filing: 14.10.2016. Date of publication: 18.05.2017. Bull. No. 14. (in Russian)Liu W., Saint D. A. Validation of a quantitative method for real-time PCR kinetics. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2002; 294 (2): 347–353. DOI: 10.1016/S0006-291X(02)00478-3.Liu W., Saint D. A. Validation of a quantitative method for real-time PCR kinetics. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2002; 294 (2): 347–353. DOI: 10.1016/S0006-291X(02)00478-3.Peirson S. N., Butler J. M., Foster R. G. Experimantal validation of novel and conventional approaches to quantitative real-time PCR data analysis. Nucleic Acids Res. 2003; 31 (14):e73. DOI: 10.1093/nar/gng073.Peirson S. N., Butler J. M., Foster R. G. Experimantal validation of novel and conventional approaches to quantitative real-time PCR data analysis. Nucleic Acids Res. 2003; 31 (14):e73. DOI: 10.1093/nar/gng073.Shaw A. E., Reid S. M., Ebert K., Hutchings G. H., Ferris N. P., King D. P. Implementation of a one-step real-time RT-PCR protocol for diagno sis of foot-and-mouth disease. J. Virol. Methods. 2007; 143 (1): 81–85. DOI: 10.1016/j.jviromet.2007.02.009.Shaw A. E., Reid S. M., Ebert K., Hutchings G. H., Ferris N. P., King D. P. Implementation of a one-step real-time RT-PCR protocol for diagno sis of foot-and-mouth disease. J. Virol. Methods. 2007; 143 (1): 81–85. DOI: 10.1016/j.jviromet.2007.02.009.Scherbakov A., Lomakina N., Drygin V., Gusev А. Application of RT-PCR and nucleotide sequencing in foot-and-mouth disease diagnosis. Veterinary Quarterly. 1998; 20 (2): 32–34. DOI: 10.1080/01652176.1998.9694962.Scherbakov A., Lomakina N., Drygin V., Gusev А. Application of RT-PCR and nucleotide sequencing in foot-and-mouth disease diagnosis. Veterinary Quarterly. 1998; 20 (2): 32–34. DOI: 10.1080/01652176.1998.9694962.Wernike K., Beer M., Hoffmann B. Rapid detection of foot-and-mouth disease virus, influenza A virus and classical swine fever virus by high-speed real-time RT-PCR. J. Virol. Methods. 2013; 193 (1): 50–54. DOI: 10.1016/j.jviromet.2013.05.005.Wernike K., Beer M., Hoffmann B. Rapid detection of foot-and-mouth disease virus, influenza A virus and classical swine fever virus by high-speed real-time RT-PCR. J. Virol. Methods. 2013; 193 (1): 50–54. DOI: 10.1016/j.jviromet.2013.05.005.Chomczynski P., Sacchi N. The single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction: twentysomething years on. Nat. Protoc. 2006; 1 (2): 581–585. DOI: 10.1038/nprot.2006.83.Chomczynski P., Sacchi N. The single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction: twentysomething years on. Nat. Protoc. 2006; 1 (2): 581–585. DOI: 10.1038/nprot.2006.83.Peirson S. N., Butler J. N. RNA extraction from mammalian tissues. In: Circadian Rhythms. Methods in Molecular Biology™. Eds E. Rosato. 2007; 362: 315–327. DOI: 10.1007/978-1-59745-257-1_22.Peirson S. N., Butler J. N. RNA extraction from mammalian tissues. In: Circadian Rhythms. Methods in Molecular Biology™. Eds E. Rosato. 2007; 362: 315–327. DOI: 10.1007/978-1-59745-257-1_22.The analysis of DNA or RNA using its wavelengths: 230 nm, 260 nm, 280 nm. Available at: https://www.webcitation.org/6ATzE7YQz?url=http://bioteachnology.com/dna/analysis-dna-rna-wavelengths-230-260-280-nm (date of access: 02.06.2019).The analysis of DNA or RNA using its wavelengths: 230 nm, 260 nm, 280 nm. Available at: https://www.webcitation.org/6ATzE7YQz?url=http://bioteachnology.com/dna/analysis-dna-rna-wavelengths-230-260-280-nm (date of access: 02.06.2019).Glasel J. A. Validity of nucleic acid purities monitored by 260 nm/280 nm absorbance ratios. Biotechniques. 1995; 18 (1): 62–63. PMID: 7702855.Glasel J. A. Validity of nucleic acid purities monitored by 260 nm/280 nm absorbance ratios. Biotechniques. 1995; 18 (1): 62–63. PMID: 7702855.Rutledge R. G., Côté C. Mathematics of quantitative kinetic PCR and the application of standard curves. Nucleic Acids Res. 2004; 31 (16):e93. DOI: 10.1093/nar/gng093.Rutledge R. G., Côté C. Mathematics of quantitative kinetic PCR and the application of standard curves. Nucleic Acids Res. 2004; 31 (16):e93. DOI: 10.1093/nar/gng093.Wittwer C. T., Gutekunst M., Lohmann S. Method for quantification of an analyte. Patent No. 6,503,720 B2 United States, Int. Cl. C12Q 1/68, C12P 19/34; C07H 21/04; CO7H 21/00. Roche Diagnostics GmbH (DE); University of Utah Research Foundation, Salt Lake City, UT (US). Appl. No. 09/789,170. Filed: Feb. 20, 2001. Prior publication data: Mar. 7, 2002. Date of patent: Jan. 7, 2003.Wittwer C. T., Gutekunst M., Lohmann S. Method for quantification of an analyte. Patent No. 6,503,720 B2 United States, Int. Cl. C12Q 1/68, C12P 19/34; C07H 21/04; CO7H 21/00. Roche Diagnostics GmbH (DE); University of Utah Research Foundation, Salt Lake City, UT (US). Appl. No. 09/789,170. Filed: Feb. 20, 2001. Prior publication data: Mar. 7, 2002. Date of patent: Jan. 7, 2003.

The authors declare that there are no conflicts of interest present.