veterinaryВетеринария сегодняVeterinary Science Today2304-196X2658-6959"Veinard"10.29326/2304-196X-2020-3-34-186-192veterinary-497Research ArticleБОЛЕЗНИ ПТИЦAVIAN DISEASESРазработка метода ОТ-ПЦР в режиме реального времени для выявления РНК вируса гриппа птиц подтипа N2Development of real-time RT-PCR for N2 subtype avian influenza RNA-virus detectionАкшаловаП. Б.AkshalovaP. B.

Акшалова Перизат Батырханкызы, аспирант, сотрудник референтной лаборатории вирусных болезней птиц

600901, г. Владимир, мкр. Юрьевец

Perizat B. Akshalova, Post-Graduate Student, Researcher, Reference Laboratory for Avian Viral Diseases

600901, Vladimir, Yur’evets

akshalova@arriah.ruhttps://orcid.org/0000-0001-6314-2119АндриясовА. В.AndriyasovA. V.

Андриясов Артем Валерьевич, кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник референтной лаборатории вирусных болезней птиц

г. Владимир

Artem V. Andriyasov, Leading Researcher, Candidate of Science (Biology), Reference Laboratory for Avian Viral Diseases

Vladimir

andriyasov_av@arriah.ruhttps://orcid.org/0000-0001-5434-6179ЩербаковаЛ. О.ScherbakovaL. O.

Щербакова Лидия Олеговна, кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник референтной лаборатории вирусных болезней птиц

г. Владимир

Lidia O. Scherbakova, Candidate of Science (Biology), Leading Researcher, Reference Laboratory for Avian Viral Diseases

Vladimir

scherbakova@arriah.ruhttps://orcid.org/0000-0002-8467-180XКолосовС. Н.KolosovS. N.

Колосов Сергей Николаевич, кандидат биологических наук, сотрудник референтной лаборатории вирусных болезней птиц

г. Владимир

Sergey N. Kolosov, Candidate of Science (Biology), Researcher, Reference Laboratory for Avian Viral Diseases

Vladimir

kolosov@arriah.ruhttps://orcid.org/0000-0002-3015-5594ЗиняковН. Г.ZinyakovN. G.

Зиняков Николай Геннадьевич, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник референтной лаборатории вирусных болезней птиц

г. Владимир

Nikolay G. Zinyakov, Candidate of Science (Biology), Senior Researcher, Reference Laboratory for Avian Viral Diseases

Vladimir

zinyakov@arriah.ruhttps://orcid.org/0000-0002-1659-3256ЧвалаИ. А.ChvalaI. A.

Чвала Илья Александрович, кандидат ветеринарных наук, заместитель директора по НИР и мониторингу

г. Владимир

Ilya A. Chvala, Candidate of Science (Veterinary Medicine), Deputy Director for Research and Monitoring

Vladimir

chvala@arriah.ruhttps://orcid.org/0000-0002-1681-5795АндрейчукД. Б.AndreychukD. B.

Андрейчук Дмитрий Борисович, кандидат биологических наук, заведующий референтной лабораторией вирусных болезней птиц

г. Владимир

Dmitry B. Andreychuk, Candidate of Science (Biology), Head of Reference Laboratory for Avian Viral Diseases

Vladimir

andreychuk@arriah.ruФГБУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» (ФГБУ «ВНИИЗЖ»)РоссияFGBI “Federal Centre for Animal Health” (FGBI “ARRIAH”)Russian Federation20201609202003186192Copyright © Акшалова П.Б., Андриясов А.В., Щербакова Л.О., Колосов С.Н., Зиняков Н.Г., Чвала И.А., Андрейчук Д.Б., 20202020Акшалова П.Б., Андриясов А.В., Щербакова Л.О., Колосов С.Н., Зиняков Н.Г., Чвала И.А., Андрейчук Д.Б.Akshalova P.B., Andriyasov A.V., Scherbakova L.O., Kolosov S.N., Zinyakov N.G., Chvala I.A., Andreychuk D.B.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://veterinary.arriah.ru/jour/article/view/497

В настоящее время вирус гриппа птиц подтипа N2 активно циркулирует в популяциях домашних и диких птиц, и его регулярно выявляют в Китае, других странах Азии и России, особенно в комбинации с гемагглютинином подтипа H9. Поэтому применение метода для быстрого обнаружения данного инфекционного агента крайне необходимо. В представленной работе приводятся данные по выбору олигонуклеотидных праймеров и оптимизации условий постановки полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией в режиме реального времени для выявления вируса гриппа птиц подтипа N2. Для амплификации фрагмента гена нейраминидазы подтипа N2 были апробированы предложенные в 2016 году B. Hoffmann праймеры и зонд в модификации, а также выбранные в ходе исследования оригинальные праймеры и зонды с вирусами, имеющимися в рабочей коллекции лаборатории. В ходе работы определены оптимальные концентрации компонентов реакционной смеси для проведения полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией в режиме реального времени и температурно-временной режим. Разные комбинации праймеров тестировали на десяти изолятах вируса гриппа птиц подтипа N2, генетически отличающихся друг от друга по гену N. Девять вирусов выделены от птиц из регионов Российской Федерации и относятся к различным генетическим группам. Специфичность метода проверяли методом полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией в режиме реального времени с использованием изолятов вируса гриппа птиц с другим подтипом нейраминидазы (H5N8, H3N6, H4N6, H5N1, H10N7), а также проб, содержащих РНК вирусов ньюкаслской болезни, инфекционного бронхита кур и инфекционной бурсальной болезни. В результате проведенных исследований были подобраны и оптимизированы условия постановки полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией в режиме реального времени, которые обеспечивают высокую чувствительность и специфичность метода.

Currently, N2 subtype avian influenza (AI) virus actively circulates in domestic and wild bird populations and is regularly detected in China, other Asian countries and Russia, particularly in combination with H9 hemagglutinin. Therefore, a method for rapid detection of the said infectious agent is urgently required. Data on oligonucleotide primer selection and reverse transcription real-time polymerase chain reaction condition optimization for N2 AI virus detection are presented in the paper. Modified primers and probe proposed by B. Hoffmann in 2006 as well as original primers and probes with the viruses available in the Laboratory working collection and selected during testing were assessed for N2 neuraminidase gene fragment amplification. Optimal concentrations of real-time RT-PCR master mix components and temperature-time mode were determined. Various combinations of primers were tested against ten N2 avian influenza virus isolates that genetically differed from each other in N gene. Nine viruses were isolated from birds in the Russian Federation regions and classified to different genetic groups. The real-time RT-PCR assay was tested for its specificity using AI virus isolates of different neuraminidase subtypes (H5N8, H3N6, H4N6, H5N1, H10N7) as well as samples containing other RNA-viruses: Newcastle disease virus, infectious bronchitis virus and infectious bursal disease virus. As a result of the testing, real-time RT-PCR conditions providing high sensitivity and specificity of the assay were selected and optimized.

вирус гриппа птицОТ-ПЦР-РВоптимизацияподтип нейраминидазы N2чувствительностьспецифичностьavian influenza virusreal-time RT-PCRoptimizationN2 neuraminidase subtypesensitivityspecificityРабота выполнена за счет бюджетных средств в рамках выполнения государственного задания по теме «Разработка методов определения первичной структуры гена N подтипов N2 и N8 и гена Н вируса гриппа птиц с помощью ОТ-ПЦР и нуклеотидного секвенирования».The works were financed by the budget in the framework of the official programme: “Development of the methods for determination of primary structure of N gene of N2 and N8 subtype and H gene of AIV with RT-PCR and nucleotide sequencing”.ReferencesAlexander D. J. Orthomyxovirus infections. In: Virus Infections of Birds. Vol. 3. Ed. by J. B. McFerran, M. S. McNulty. Amsterdam: Elsevier; 1993; 287–316.Alexander D. J. Orthomyxovirus infections. In: Virus Infections of Birds. Vol. 3. Ed. by J. B. McFerran, M. S. McNulty. Amsterdam: Elsevier; 1993; 287–316.Штыря Ю. А., Мочалова Л. В., Бовин Н. В. Нейраминидаза вируса гриппа: структура и функция. Acta Naturae. 2009; 1 (2): 28–34. eLIBRARY ID: 15119687.Shtyrya Y. A., Mochalova L. V., Bovin N. V. Influenza virus neuraminidase: structure and function. Acta Naturae. 2009; 1 (2): 28–34. eLIBRARY ID: 15119687. (in Russian)Tong S., Li Y., Rivailler P., Conrardy Ch., Castillo D. A., Chen L.-M., et al. A distinct lineage of influenza A virus from bats. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2012; 109 (11): 4269–4274. DOI: 10.1073/pnas.1116200109.Tong S., Li Y., Rivailler P., Conrardy Ch., Castillo D. A., Chen L.-M., et al. A distinct lineage of influenza A virus from bats. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2012; 109 (11): 4269–4274. DOI: 10.1073/pnas.1116200109.Tong S., Zhu X., Li Y., Shi M., Zhang J., Bourgeois M., et al. New world bats harbor diverse influenza A viruses. PLoS Pathog. 2013; 9 (10):e1003657. DOI: 10.1371/journal.ppat.1003657.Tong S., Zhu X., Li Y., Shi M., Zhang J., Bourgeois M., et al. New world bats harbor diverse influenza A viruses. PLoS Pathog. 2013; 9 (10):e1003657. DOI: 10.1371/journal.ppat.1003657.Spackman E., Senne D. A., Myers T. J., Bulaga L. L., Garber L. P., Perdue M. L., et al. Development of a real-time reverse transcriptase PCR assay for type A influenza virus and the avian H5 and H7 hemagglutinin subtypes. J. Clin. Microbiol. 2002; 40 (9): 3256–3260. DOI: 10.1128/JCM.40.9.3256-3260.2002.Spackman E., Senne D. A., Myers T. J., Bulaga L. L., Garber L. P., Perdue M. L., et al. Development of a real-time reverse transcriptase PCR assay for type A influenza virus and the avian H5 and H7 hemagglutinin subtypes. J. Clin. Microbiol. 2002; 40 (9): 3256–3260. DOI: 10.1128/JCM.40.9.3256-3260.2002.Avian influenza (infection with avian influenza viruses). In: OIE Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals. 7 th еd. Paris, 2018. Chap. 3.03.04. Available at: http://www.oie.int/fileadmin/Home/eng/Health_standards/tahm/3.03.04_AI.pdf.Avian influenza (infection with avian influenza viruses). In: OIE Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals. 7 th еd. Paris, 2018. Chap. 3.03.04. Available at: http://www.oie.int/fileadmin/Home/eng/Health_standards/tahm/3.03.04_AI.pdf.Suarez D. L., Das A., Ellis E. Review of rapid molecular diagnostic tools for avian influenza virus. Avian Dis. 2007; 51 (1 Suppl): 201–208. DOI: 10.1637/7732-101006-REGR.1.Suarez D. L., Das A., Ellis E. Review of rapid molecular diagnostic tools for avian influenza virus. Avian Dis. 2007; 51 (1 Suppl): 201–208. DOI: 10.1637/7732-101006-REGR.1.Pedersen J. C. Neuraminidase-inhibition assay for the identification of influenza A virus neuraminidase subtype or neuraminidase antibody specificity. Methods Mol. Biol. 2008; 436: 67–75. DOI: 10.1007/978-1-59745279-3_9.Pedersen J. C. Neuraminidase-inhibition assay for the identification of influenza A virus neuraminidase subtype or neuraminidase antibody specificity. Methods Mol. Biol. 2008; 436: 67–75. DOI: 10.1007/978-1-59745279-3_9.Волкова М. А., Чвала Ир. А., Ярославцева П. С., Сосипаторова В. Ю., Осипова О. С., Чвала И А. Серологический мониторинг гриппа птиц в Российской Федерации в 2017–2018 годах. Ветеринария сегодня. 2019; 2 (29): 3–7. DOI: 10.29326/2304-196X-2019-2-29-3-7.Volkova M. A., Chvala I. A., Yaroslavtseva P. S., Sosipatorova V. Yu., Osipova O. S., Chvala I. A. Serological monitoring for avian influenza in the Russian Federation in 2017–2018. Veterinary Science Today. 2019; 2 (29): 8–11. DOI: 10.29326/2304-196X-2019-2-29-3-7.Зиняков Н. Г., Осипова О. С., Акшалова П. Б., Сосипаторова В. Ю., Андриясов А. В., Андрейчук Д. Б., Чвала И. А. Анализ генетических свойств изолята вируса гриппа A/chicken/Chelyabinsk/30/2019 H9N2, выделенного на территории Челябинской области. Ветеринария сегодня. 2019; 4 (31): 49–53. DOI: 10.29326/2304-196X-2019-4-31-49-53.Zinyakov N. G., Osipova O. S., Akshalova P. B., Sosipatorova V. Yu., Andriyasov A. V., Andreychuk D. B., Chvala I. A. Analysis of genetic characteristics of influenza virus A/chicken/Chelyabinsk/30/2019 H9N2 iso lated in Chelyabinsk oblast. Veterinary Science Today. 2019; 4 (31): 49–53. DOI: 10.29326/2304-196X-2019-4-31-49-53.Hoffmann B., Hoffmann D., Henritzi D., Beer M., Harder T. C. Riems influenza a typing array (RITA): An RT-qPCR based low-density array for subtyping avian and mammalian influenza a viruses. Sci. Rep. 2016; 6:27211. DOI: 10.1038/srep27211.Hoffmann B., Hoffmann D., Henritzi D., Beer M., Harder T. C. Riems influenza a typing array (RITA): An RT-qPCR based low-density array for subtyping avian and mammalian influenza a viruses. Sci. Rep. 2016; 6:27211. DOI: 10.1038/srep27211.Андриясов А. В., Андрейчук Д. Б., Чвала И. А. Методические рекомендации по выявлению РНК вируса гриппа птиц типа А методом ОТ-ПЦР в режиме реального времени: утв. ФГБУ «ВНИИЗЖ» 31.05.2016 № 45-16. Владимир: 2016. 13 с.Andriyasov A. V., Andreychuk D. B., Chvala I. A. Methodical Guidelines for detection of avian influenza A virus RNA with real-time RT-PCR [Metodicheskie rekomendacii po vyyavleniyu RNK virusa grippa ptic tipa A metodom OT-PCR v rezhime real'nogo vremeni]: approved by the FGBI “ARRIAH” on May 31, 2016, No. 45-16. Vladimir: 2016. 13 p. (in Russian)Ребриков Д. В., Саматов Г. А., Трофимов Д. Ю., Семенов П. А., Савилова А. М., Кофиади И. А., Абрамов Д. Д. ПЦР в реальном времени. Под ред. Д. В. Ребрикова. М.: БИНОМ. Лаборатория знаний. 2009. 223 с.Rebrikov D. V., Samatov G. A., Trofimov D. Yu., Semenov P. A., Savilova A. M., Kofiadi I. A., Abramov D. D. Real-time PCR. Ed. by D. V. Rebrikov. M.: BINOM. Laboratoriya znaniy. 2009. 223 p. (in Russian)

The authors declare that there are no conflicts of interest present.