veterinaryВетеринария сегодняVeterinary Science Today2304-196X2658-6959"Veinard"10.29326/2304-196X-2019-1-28-43-50veterinary-401Research ArticleБИОТЕХНОЛОГИЯBIOTECHNOLOGYВАЛИДАЦИЯ ОБРАТНО-ТРАНСКРИПТАЗНОЙ ПЦР В РЕЖИМЕ РЕАЛЬНОГО ВРЕМЕНИ ДЛЯ ОПОСРЕДОВАННОЙ ОЦЕНКИ ТИТРА ВИРУСА ЯЩУРАVALIDATION OF REAL-TIME REVERSE TRANSCRIPTION POLYMERASE CHAIN REACTION FOR INDIRECT ASSESSMENT OF FMD VIRUS TITREЛозовойД. А.LozovoyD. A.

Директор, кандидат ветеринарных наук

Владимир

Director, Candidate of Science (Veterinary Medicine)

Vladimir

lozovoy@arriah.ruДоронинМ. И.DoroninM. I.

Научный сотрудник, кандидат биологических наук

Владимир

Researcher, Candidate of Science (Biology)

Vladimir

doronin@arriah.ruСтариковВ. А.StarikovV. A.

Ведущий научный сотрудник, кандидат ветеринарных наук

Владимир

Leading Researcher, Candidate of Science (Veterinary Medicine)

Vladimir

starikov@arriah.ruМихалишинД. В.MikhalishinD. V.

Заведующий лабораторией, кандидат ветеринарных наук

Владимир

Head of Laboratory, Candidate of Science (Veterinary Medicine)

Vladimir

mihalishindv@arriah.ruШишковаА. А.ShishkovaA. A.

Главный технолог, кандидат ветеринарных наук

Владимир

Chief Technologist, Candidate of Science (Veterinary Medicine)

Vladimir

shishkova@arriah.ruТиминаА. М.TiminaA. M.

Ведущий научный сотрудник, кандидат ветеринарных наук

Владимир

Leading Researcher, Candidate of Science (Veterinary Medicine)

Vladimir

timina@arriah.ruБорисовА. В.BorisovA. B.

Ведущий научный сотрудник, кандидат ветеринарных наук

Владимир

Leading Researcher, Candidate of Science (Veterinary Medicine)

Vladimir

borisov@arriah.ruФГБУ «ВНИИЗЖ», г. ВладимирРоссияFGBI "ARRIAH", VladimirRussian Federation201901042019014350Copyright © Лозовой Д.А., Доронин М.И., Стариков В.А., Михалишин Д.В., Шишкова А.А., Тимина А.М., Борисов А.В., 20192019Лозовой Д.А., Доронин М.И., Стариков В.А., Михалишин Д.В., Шишкова А.А., Тимина А.М., Борисов А.В.Lozovoy D.A., Doronin M.I., Starikov V.A., Mikhalishin D.V., Shishkova A.A., Timina A.M., Borisov A.B.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://veterinary.arriah.ru/jour/article/view/401

В статье описан процесс валидации методики для опосредованной оценки титра культурального вируса ящура (Твя) в сырье для вакцины методом полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией в режиме реального времени на основании установленной величины порогового цикла амплификации (Ct) с применением линейной регрессионной модели Т вя = –0,2956C t+ 11,4650. Проведен анализ полученных результатов исследования 390 проб культурального вируса ящура и определены основные валидационные характеристики предложенной методики: специфичность, правильность, прецизионность, предел обнаружения и количественного определения, диапазон применения и линейность. Результаты валидации методики для опосредованной оценки титра вируса ящура в ОТ-ПЦР-РВ удовлетворяли критериям приемлемости.

Procedure for validation of the method for indirect assessment of cultural FMD virus titre (T FMDV) in raw materials used for vaccine production with real time reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCRrt) based on determined amplifcation threshold cycle value (Ct) using linear regression model, TFMDV= –0.2956Ct+ 11.4650, is described in the paper. Testing results for 390 samples of cultural FMD virus were analyzed and basic validation characteristics of the proposed method: specifcity, accuracy, precision, limit of detection and limit of quantifcation, application scope and linearity, were defned. Validation results for the method for indirect assessment of FMD virus titre with RT-PCRrt met the acceptance criteria.

ящуртитр инфекционной активности вирусавалидацияОТ-ПЦР-РВпороговый цикл амплификацииfoot-and-mouth disease (FMD)virus infectivity titrevalidationRT-PCRrtamplifcation threshold cycleReferencesВзаимосвязь инфекционности и концентрации 146S частиц в суспензии лапинизированного вируса ящура / М. В. Котова, В. Л. Узюмов, О. Г. Андреева, М. Г. Удалых // Актуальные проблемы ветеринарной вирусологии: тез. докладов науч. конф. ВНИЯИ. – Владимир, 1983. – С. 46–48.Interrelation between infectivity and 146S particle concentration in lapinized foot-and-mouth disease virus suspension [Vzaimosvyaz’ infekcionnosti i koncentracii 146S chastic v suspenzii lapinizirovannogo virusa yashchura]. М. V. Kotova, V. L. Uzyumov, О. G. Andreyeva, М. G. Udalykh. Aktual’nye problemy veterinarnoj virusologii: scientific conference abstracts All-Union Foot and Mouth Disease Research Institute. Vladimir, 1983: 46–48 (in Russian).ГОСТ Р ИСО 5725-2002. Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Ч. 1–6. – Введ. 01.11.02. – М.: Стандартинформ, 2006.GOST R ISO 5725-2002. Accuracy (trueness and precision) of measurement methods and results [Tochnost’ (pravil’nost’ i precizionnost’) metodov i rezul’tatov izmerenij]. Part 1–6. Put into force on 01.11.02. М.: Standartinform, 2006 (in Russian).Государственная фармакопея РФ. Ч. 1. – 12-е изд. – М.: Научный центр экспертизы средств медицинского назначения, 2008. – С. 254–266.RF National Pharmacopeia Part 1. [Gosudarstvennaya farmakopeya RF]. 12th ed. М.: Scientific Centre for Medical Device Examination, 2008: 254–266 (in Russian).Жильцова М. В. Биологические свойства эпизоотических изолятов вируса ящура типов А, О и Азия-1: автореф. дис. … канд. наук. – Владимир, 2008. – 23 с.Zhiltsova М. V. Biological properties of epidemic type A, O and Asia-1 foot-and-mouth disease virus isolates [Biologicheskie svojstva ehpizooticheskih izolyatov virusa yashchura tipov A, O i Aziya-1]: author’s abstract … for Candidate of Science degree. Vladimir, 2008 (in Russian).Лакин Г. Ф. Биометрия: учебное пособие для биол. спец. вузов. – 4-е изд., перераб. и доп. – М.: Высшая школа, 1990. – 352 с.Lakin G. F. Biometrics: text book for Biological Higher Educational Institutes [Biometriya: uchebnoe posobie dlya biol. spec. vuzov]. 4th ed., revised and amended. М.: Vyshaya shkola, 1990 (in Russia).Пономарев А. П., Узюмов В. Л., Груздев К. Н. Вирус ящура: структура, биологические и физико-химические свойства. – Владимир: Фолиант, 2006. – 250 с.Ponomaryov А. P., Uzyumov V. L., Gruzdev K. N. Foot-and-mouth disease virus: its structure, biological, physical and chemical properties [Virus yashchura: struktura, biologicheskie i fziko-himicheskie svojstva]. Vladimir: Foliant. 2006 (in Russian).Практикум по GMP. Валидация аналитических методик: теория / П. Носырев, М. Носырева, Т. Рассказова, Н. Корнеева. – URL: http://www.nedug.ru/news/farmatsevtika/2004/2/12/Praktikum-po-GMP--Validatsiya-analiticheskikh-metodik--teoriya (дата обращения: 12.11.18).Manual of GMP. Validation of analytical methods: theory [Praktikum po GMP. Validaciya analiticheskih metodik: teoriya]. P. Nosyrev, М. Nosyreva, Т. Rasskazova, N. Korneyeva. URL: http://www.nedug.ru/news/фармацевтика/2004/2/12/Практикум-по-GMP--Валидация-аналитическихметодик--теория (access date: 12.11.18) (in Russian).Способ определения титра инфекционной активности вируса ящура в неинактивированном сырье для вакцины с применением метода обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции в режиме реального времени: пат. 2674076 Российская Федерация, МПК7 А61К 39/135 / Д. В. Михалишин, М. И. Доронин, В. А. Стариков [и др.]; ФГБУ «ВНИИЗЖ». – № 2017145889/10; заявл. 25.12.17; опубл. 04.12.18.Method for determination of foot-and-mouth disease virus infectivity titre in non-inactivated raw materials used for vaccine production with real-time reverse transcription polymerase chain reaction [Sposob opredeleniya titra infekcionnoj aktivnosti virusa yashchura v neinaktivirovannom syr’e dlya vakciny s primeneniem metoda obratnoj transkripcii i polimeraznoj cepnoj reakcii v rezhime real’nogo vremeni]: pat. 2674076 Russian Federation, MPK7 А61К 39/135. D. V. Mikhalishin, М. I. Doronin, V. А. Starikov [et al.]; FGBI “ARRIAH”. No. 2017145889/10; submitted on 25.12.17; published on 04.12.18 (in Russian).Щербаков А. В., Тимина А. М., Перевозчикова Н. А. Разработка ПЦР в реальном времени для обнаружения и количественного определения вируса ящура // Рос. вет. журн. С.-х. животные. Спец. вып., посвящ. 50-летию ФГУ «ВНИИЗЖ». – 2008. – Сент. – С. 26–27.Scherbakov А. V., Timina А. М., Perevozchikova N. А. Development of real-time PCR for foot-and-mouth disease virus detection and quantifcation [Razrabotka PCR v real’nom vremeni dlya obnaruzheniya i kolichestvennogo opredeleniya virusa yashchura]. Russian Veterinary Journal. Productive animals. Special issue devoted to the 50th anniversary of the FGBI “ARRIAH”. 2008; September: 26–27 (in Russian).Implementation of a one-step real-time RT-PCR protocol for diagnosis of foot-and-mouth disease / A. E. Shaw, S. M. Reid, K. Ebert [et al.] // J. Virol. Methods. – 2007. – Vol. 143 (1). – P. 81–85; DOI: 10.1016/j.jviromet.2007.02.009.Implementation of a one-step real-time RT-PCR protocol for diagnosis of foot-and-mouth disease. A. E. Shaw, S. M. Reid, K. Ebert [et al.]. J. Virol. Methods. 2007; 143 (1): 81–85; DOI: 10.1016/j.jviromet.2007.02.009.Principles and methods of validation of diagnostic assays for infectious diseases / OIE. Terrestrial Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals (Mammals, Birds and Bees). – Chapter 1.1.1. – URL: http://www.oie.int/fleadmin/Home/eng/Health_standards/aahm/current/chapitre_validation_diagnostics_assays.pdf (дата обращения: 02.11.18).Principles and methods of validation of diagnostic assays for infectious diseases. OIE. Terrestrial Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals (Mammals, Birds and Bees). Chapter 1.1.1. URL: http://www.oie.int/fileadmin/Home/eng/Health_standards/aahm/current/chapitre_validation_diagnostics_assays.pdf (access data: 02.11.18).Quality Standard and Guidelines for Veterinary Laboratories: Infectious Diseases / OIE. – 2nd ed. – Paris: OIE, 2008. – 70 p.Quality Standard and Guidelines for Veterinary Laboratories: Infectious Diseases. 2nd ed. Paris: OIE, 2008.

The authors declare that there are no conflicts of interest present.