veterinaryВетеринария сегодняVeterinary Science Today2304-196X2658-6959"Veinard"10.29326/2304-196X-2018-4-27-44-48veterinary-391Research ArticleБИОТЕХНОЛОГИЯBIOTECHNOLOGYХРАНЕНИЕ ПОЧЕК ПОРОСЯТ ПРИ СУБНОРМАЛЬНЫХ ТЕМПЕРАТУРАХ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ МОНОСЛОЯ ПЕРВИЧНО ТРИПСИНИЗИРОВАННЫХ КЛЕТОКSTORAGE OF PIGLET KIDNEYS AT SUBNORMAL TEMPERATURES FOR PRIMARY TRYPSINIZED CELL MONOLAYER PREPARATIONМанинБ. Л.ManinB. L.

Ведущий научный сотрудник, кандидат биологических наук

Владимир

Leading Researcher, Candidate of Science (Biology)

Vladimir

manin_bl@arriah.ruКороповаН. В.KoropovaN. V.

Старший научный сотрудник, кандидат ветеринарных наук

Владимир

Senior Researcher, Candidate of Science (Veterinary Medicine)

Vladimir

СтариковВ. А.StarikovV. A.

Ведущий научный сотрудник, кандидат ветеринарных наук

Владимир

Leading Researcher, Candidate of Science (Veterinary Medicine)

Vladimir

starikov@arriah.ruВологинаИ. В.VologinaI. V.

Ведущий научный сотрудник, кандидат ветеринарных наук

Владимир

Leading Researcher, Candidate of Science (Veterinary Medicine)

Vladimir

vologina@arriah.ruФГБУ «ВНИИЗЖ», г. ВладимирРоссияFGBI "ARRIAH", VladimirRussian Federation201826012019044448Copyright © Манин Б.Л., Коропова Н.В., Стариков В.А., Вологина И.В., 20192019Манин Б.Л., Коропова Н.В., Стариков В.А., Вологина И.В.Manin B.L., Koropova N.V., Starikov V.A., Vologina I.V.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://veterinary.arriah.ru/jour/article/view/391

Длительное хранение внутренних органов и тканей необходимо для рационализации технологического процесса получения первичных клеток, пригодных для вирусологических исследований. Представлены результаты изучения сохранности органов при субнормальных температурах в лабораторных условиях с целью дальнейшего получения полноценного монослоя первичных клеток. Предложен способ хранения до 6 сут изолированной в стерильных условиях почки 3–5-месячного поросенка. В качестве стабилизирующей субстанции использовали среду 199 без сыворотки с добавлением 100 ед./мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 100 ед./мл гентамицина. Для оптимизации химического гомеостаза среды хранения орган помещали в емкость с широким горлом, в которой соотношение среды и воздушной фазы было 1:1, накрывали чашкой Петри. Хранили при температуре от –1 до +4 °С до 6 сут, не допуская кристаллизации среды и органа. Сделано заключение, что любое замораживание с кристаллизацией (при –2 до –4 °С) без криопротекторов отрицательно сказывается на выживаемости клеток и тканей органов. По окончании срока хранения почки проводили трипсинизацию с получением полноценного монослоя первичной культуры. При проведении вирусологических работ все варианты полученного клеточного материала были пригодны для определения авирулентности полуфабрикатов, проведения реакции нейтрализации и выделения вируса ящура. Предложенный метод хранения почек поросят позволяет более рационально использовать донорские органы для получения первичных культур, используемых в вирусологии. Этот способ хранения органов может быть рекомендован для консервирования и транспортировки органов, полученных в полевых условиях от домашних и диких животных.

Optimization of the technology for preparation of the primary cells suitable for virological studies requires long-term storage of internal organs and tissues. Results of tests of organs stored at subnormal temperatures under laboratory conditions for the purpose of further preparation of complete monolayer of primary cells for their preservation are presented. Method for 6-day storage of kidneys aseptically taken from 3–5 month-old piglets was proposed. Serum-free medium 199 supplemented with 100 U/ml of penicillin, 100 µg/ml of streptomycin, 100 U/ml of gentamycin was used as a stabilizing substance. The organ was placed in a wide-neck vessel at medium/air phase ratio of 1:1 and the vessel was covered by a Petri dish to optimize medium chemical homeostasis and stored at temperature of –1 to +4 °C up to 6 days avoiding medium and organ crystallization. It was concluded that any freezing with crystallization and without cryoprotector (of –2 to –4 °С) had a negative effect on cell and organ tissue survivability. Trypsinization and complete monolayer preparation were carried out upon the kidney storage period completion. All variants of prepared cell materials used for virological studies were suitable for testing semi-preparations for their avirulence as well as for virus neutralization tests and foot-and-mouth disease virus isolation. Proposed method for porcine kidney storage allows more effective use of donor organs for primary culture preparation for virological studies. This method of organ storage could be recommended for preservation and transportation of organs derived from domestic and wild animals under feld conditions.

первичная культура клеток почек поросенкасреда 199субнормальные температурытрипсинизацияпосевная концентрациявирус ящураpiglet kidney cell culturesmedium 199subnormal temperaturestrypsinizationseeding concentrationfoot-and-mouth disease virusReferencesКирпатовский В. И., Кудрявцев Ю. В. Криоконсервация почки крысы и кролика // Успехи современной криобиологии: материалы 11-й международной конф. – Харьков, 1992. – С. 82–83.Kirpatovsky V. I., Kudryavtsev Yu. V. Cryopreservation of rat and rabbit kidneys [Kriokonservaciya pochki krysy i krolika]. Achievements of modern cryobiology: Proceedings of the 11th International Conference. Kharkov, 1992; 82–83 (in Russian).Манин Б. Л., Коропова Н. В. Влияние артефактов биологического статуса поросят на культивирование первичной культуры, полученной из почки // Тр. Федерального центра охраны здоровья животных. – Владимир, 2012. – Т. 10. – С. 238–245.Manin B. L., Koropova N. V. Effect of pig biological status artifacts on cultivation of kidney-derived primary cultures [Vliyanie artefaktov biologicheskogo statusa porosyat na kul’tivirovanie pervichnoj kul’tury, poluchennoj iz pochki]. Proceedings of the Federal Centre for Animal Health. Vladimir, 2012; 10: 238–245 (in Russian).Манин Б. Л., Коропова Н. В, Стариков В. А. Способ хранения почки поросенка для получения первично трипсинизированных клеток и использование его в вирусологических исследованиях: пат. 2646135 Российская Федерация, МПК A01N1/02 (2006.01). – № 2016140461; заявл. 14.10.16; опубл. 01.03.18.Manin B. L., Koropova N. V. Starikov V. A. Method of storage of porcine kidneys for primary trypsinized cell preparation and their use in virological studies [Sposob hraneniya pochki porosenka dlya polucheniya pervichno tripsinizirovannyh kletok i ispol’zovanie ego v virusologicheskih issledovaniyah]: patent No. 2646135 Russian Federation, MPK A01N1/02 (2006.01). No. 2016140461; applied on 14.10.16; published on 01.03.18 (in Russian).Ночевный В. Т. Комплексная стандартизация получения первичных культур клеток // Цитология. – 1999. – Т. 41, № 3–4. – С. 298–299.Nochevny V. T. Integrated standardization of primary cell culture preparation [Kompleksnaya standartizaciya polucheniya pervichnyh kul’tur kletok]. Cell and Tissue Biology. 1999; 41 (3–4): 298–299 (in Russian).Трошина В. П. Функциональное состояние изолированных тканей при температуре, близкой к нулю // Вестник Ленинградского ун-та. – 1957. – № 3. – С. 111–121.Troshina V. P. Functional state of isolated tissues at temperatures close to zero [Funkcional’noe sostoyanie izolirovannyh tkanej pri temperature, blizkoj k nulyu]. Vestnik Leningradskogo universiteta. 1957; 3: 111–121 (in Russian).Фрешни Р. Я. Культура животных клеток. Практическое руководство. – М.: Бином. Лаборатория знаний, 2011. – 691 с.Freshney R. Yan Culture of Animal Cells. A Manual of Basic Technique. М.: Binom. Laboratoriya znaniy, 2011 (in Russian).Юрченко Т. Н., Жуликова Е. П., Говоруха Т. П. Структурно-функциональные показатели клеток печени на этапах подготовки к криоконсервации // Проблемы криобиологии. – 1991. – № 1. – С. 8–16.Yurchenko T. N., Zhulikova Ye. P., Govorukha T. P. Structural and functional characteristics of kidney cells at the stages of their preparation for cryopreservation [Strukturno-funkcional’nye pokazateli kletok pecheni na etapah podgotovki k kriokonservacii]. Problems of Cryobiology. 1991; 1: 8–16 (in Russian).Янгсон Р.-М. Хирургия. Что и зачем делает хирург? – Минск: Попурри, 1997. – 592 с.Yangson R.-М. Khirurgiya. What and why surgeon is doing? [Hirurgiya. Chto i zachem delaet hirurg?] Minsk: Poppuri, 1997. (in Russian).Jeske A. H., Fonteles M. C., Karow A. M. Functional preservation of the mammalian kidney. ІІІ. Ultrastructural effects of perfusion with dimethylsulfoxide (DMSO) // Cryobiology. – 1974. – Vol. 11 (2). – P. 170–181; DOI: 10.1016/0011-2240(74)90307-1.Jeske A. H., Fonteles M. C., Karow A. M. Functional preservation of the mammalian kidney. ІІІ. Ultrastructural effects of perfusion with dimethylsulfoxide (DMSO). Cryobiology. 1974; 11 (2): 170–181; DOI: 10.1016/0011-2240(74)90307-1.

The authors declare that there are no conflicts of interest present.