veterinaryВетеринария сегодняVeterinary Science Today2304-196X2658-6959"Veinard"10.29326/2304-196X-2018-3-26-52-57veterinary-375Research ArticleБОЛЕЗНИ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТАCATTLE DISEASESТЕСТ-СИСТЕМА НА ОСНОВЕ НЕПРЯМОГО «СЭНДВИЧ»-ВАРИАНТА ИММУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИГЕНА ВИРУСА ЗАРАЗНОГО УЗЕЛКОВОГО (НОДУЛЯРНОГО) ДЕРМАТИТА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТАTEST-SYSTEM BASED ON INDIRECT “SANDWICH” ELISA TO DETECT THE LUMPY SKIN DISEASE VIRUS ANTIGENРябикинаО. А.RyabikinaO. A.

Младший научный сотрудник,

г. Владимир

Junior Researcher,

Vladimir

ryabikina@arriah.ruДиевВ. И.DievV. I.

Доктор ветеринарных наук, профессор, 

г. Владимир

Doctor of Science (Veterinary Medicine), Professor,

Vladimir

diev@arriah.ruБьядовскаяО. П.ByadovskayaO. P.

И. о. заведующего лабораторией, кандидат биологических наук, 

г. Владимир

 Interim Head of the Laboratory, Candidate of Science (Biology),

Vladimir

bjadovskaya@arriah.ruКонстантиновА. В.KonstantinovA. V.

Начальник отдела, кандидат ветеринарных наук, 

г. Владимир

Head of the Department, Candidate of Science (Veterinary Medicine),

Vladimir

konstantinov@arriah.ruСтаровС. К.StarovS. K.

Заместитель директора, кандидат ветеринарных наук, старший научный сотрудник, 

г. Владимир

Deputy Director, Candidate of Science (Veterinary Medicine), Leading Reseracher,

Vladimir

starov@arriah.ruКононовА. В.KononovA. V.

Начальник отдела, кандидат ветеринарных наук, 

г. Владимир

Head of the Department, Candidate of Science (Veterinary Medicine),

Vladimir

kononov@arriah.ruКулаковВ. Ю.KulakovV. Yu.

Ведущий научный сотрудник, кандидат ветеринарных наук, 

г. Владимир

 Leading Researcher, Candidate of Science (Veterinary Medicine),

Vladimir

kulakov@arriah.ruПетроваО. Н.PetrovaO. N.

Заведующий сектором, кандидат биологических наук, 

г. Владимир

Head of the Sector, Candidate of Science (Biology),

Vladimir

petrova@arriah.ruФГБУ «ВНИИЗЖ», г. ВладимирРоссияFGBI "ARRIAH", VladimirRussian Federation201803102018035257Copyright © Рябикина О.А., Диев В.И., Бьядовская О.П., Константинов А.В., Старов С.К., Кононов А.В., Кулаков В.Ю., Петрова О.Н., 20182018Рябикина О.А., Диев В.И., Бьядовская О.П., Константинов А.В., Старов С.К., Кононов А.В., Кулаков В.Ю., Петрова О.Н.Ryabikina O.A., Diev V.I., Byadovskaya O.P., Konstantinov A.V., Starov S.K., Kononov A.V., Kulakov V.Y., Petrova O.N.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://veterinary.arriah.ru/jour/article/view/375

Заразный узелковый дерматит крупного рогатого скота является экономически значимым заболеванием, поскольку приводит к снижению привесов и молочной продуктивности, абортам, маститам, нарушению функции воспроизводства, поражению органов дыхания, истощению животных, а в отдельных случаях – их гибели. В настоящее время болезнь включена в список МЭБ и подлежит обязательной нотификации. Возникновение и распространение заболевания на территории Российской Федерации обусловило необходимость проведения исследований в рамках совершенствования методов лабораторной диагностики. Впервые в России разработана тест-система на основе непрямого «сэндвич»-варианта иммуноферментного анализа для диагностики заразного узелкового (нодулярного) дерматита крупного рогатого скота, позволяющая в течение 24 часов провести исследование биоматериала. Разработка тест-системы включала в себя получение специфических антител от лабораторных животных (кролики и морские свинки), подбор оптимального разведения улавливающих и детекторных антител, состава буферных растворов и условий постановки реакции. С использованием разработанной методики исследовано 50 образцов исходных культуральных антигенов вируса заразного узелкового дерматита, а также вируссодержащих суспензий, отобранных на различных этапах очистки и концентрирования. Для подтверждения результатов ИФА все исследованные пробы были тестированы методом ПЦР-РВ. Кроме того, для всех исследуемых материалов определяли титр инфекционной активности вируса методом титрования в культуре клеток ЯДК-04. Диагностическая специфичность теста составила 100%, а аналитическая чувствительность – 3,5 lg ТЦД50. Разработанный «сэндвич»-вариант ИФА позволяет тестировать одновременно в формате 96-луночного планшета до 24 проб антигена в разведении 1:2–1:16 и может быть использован для диагностики заразного узелкового (нодулярного) дерматита крупного рогатого скота.

Lumpy skin disease is an economically significant disease as it results in decrease in weight gain and milk yield, abortions, mastitis, reproduction disorders, animal emaciation, lesions of respiratory organs and in some cases – death. Today the disease is included in the OIE list and is subject to obligatory notification. The emergence and spread of the disease in the Russian Federation necessitated performance of tests in the framework of laboratory diagnosis method improvement. The test-system based on the indirect “Sandwich” ELISA for diagnosis of lumpy skin disease allowing performance of biomaterial tests within 24 hours was for the first time developed in Russia. The test-system development included antibody preparation in laboratory animals (rabbits and guinea pigs), selection of optimal dilution of capture and detection antibodies, composition of a buffer solution and conditions of the reaction procedure. 50 samples of initial culture antigens of the lumpy skin disease virus as well virus-containing suspensions collected on different stages of purification and concentration were tested using this technique. To confirm the ELISA results all analyzed samples were tested using RT-PCR. Besides, the virus infectivity titer was determined by titration in YaDK-04 (Goat gonad cells). The test specificity was 100%, and analytical sensitivity – 3.5 lg TCD50. The developed “Sandwich” ELISA allows performing tests of 24 antigen samples at 1:2–1:16 dilution simultaneously using 96-well plate and it can be used for lumpy skin disease diagnosis.

заразный узелковый дерматитиммуноферментный анализтест-системакрупный рогатый скотlumpy skin diseaseELISAtest-systemcattleReferencesВидовая и штаммовая дифференциация каприпоксвирусов методом полимеразной цепной реакции / Е. С. Орлова, А. В. Щербаков, В. И. Диев, В. М. Захаров // Молекулярная биология. – 2006. – Т. 40, № 1. – С. 158–164.Species and strain differentiation of capripoxiviruses using PCR. Ye. S. Orlova, A. B. Scherbakov, V. I. Diyev, V. M. Zakharov. Molecular Biology. 2006; 40 (1): 158–164 (in Russian).Гуненков В. В. Заразный узелковый дерматит крупного рогатого скота // Сборник науч. тр. ВГНКИ. – М., 2005. – Т. 66. – С. 46–54.Gunenkov V. V. Lumpy skin disease. Sbornik nauch. tr. VGNKI. М., 2005; 66: 46–54 (in Russian).Методические рекомендации по анализу параметров в системах «доза-эффект» с альтернативным способом оценивания / В. Ю. Кулаков, С. Н. Колосов, А. В. Константинов [и др.]; ФГБУ «ВНИИЗЖ». – Владимир, 2016. – 31 с.Methodical recommendations for analysis of parameters in “doseeffect” systems using an alternative assessment method. V. Yu. Kulakov, S. N. Kolosov, A. V. Konstantinov [et al.]; FGBI “ARRIAH”. Vladimir, 2016 (in Russian).Методические указания по выявлению ДНК полевых изолятов вируса заразного узелкового дерматита (нодулярного дерматита) КРС с помощью полимеразной цепной реакции в режиме реального времени: утв. Россельхознадзором 13.09.17 / МУ 35-17; ФГБУ «ВНИИЗЖ». – Владимир, 2017. – 11 с.Methodical instructions for isolating DNA of LSD field isolates using RT-PCRМ: approved by the Rosselkhoznadzor 13.09.17. MU 35-17; FGBI “ARRIAH”. Vladimir, 2017 (in Russian).Мищенко В. А. Современная ситуация по инфекционным болезням КРС в России // Актуальные ветеринарные аспекты молочного и мясного животноводства: материалы международной конференции, 23–24 апреля 2015 г. – М., 2015. – С. 1–6.Mischenko V. A. Contemporary situation of bovine infectious diseases in Russia. Topical veterinary issues of dairy and meat livestock production: materials of the international conference, April 23–24, 2015. М., 2015: 1–6 (in Russian).Evaluation of different diagnostic methods for diagnosis of lumpy skin diseases in cows / W. S. Awad, A. K. Ibrahim, K. Mahran [et al.] // Trop. Anim. Health Prod. – 2010. – Vol. 42, No. 4. – P. 777–783; doi: 10.1007/s11250-009-9486-5.Evaluation of different diagnostic methods for diagnosis of lumpy skin diseases in cows / W. S. Awad, A. K. Ibrahim, K. Mahran [et al.]. Trop. Anim. Health Prod. 2010. Vol. 42 (4): P. 777–783; doi: 10.1007/s11250-0099486-5.Kitching R. P. Vaccines for lumpy skin disease, sheep pox and goat pox // Vaccines for OIE list A and emerging animal diseases / ed. F. Brown, J. A. Roth // Dev. Biol. (Basel). – 2003. – Vol. 114. – P. 161–167.Kitching R. P. Vaccines for lumpy skin disease, sheep pox and goat pox // Vaccines for OIE list A and emerging animal diseases / ed. F. Brown, J. A. Roth. Dev. Biol. (Basel). 2003. Vol. 114: P. 161–167.Quantification of lumpy skin disease virus following experimental infection in cattle / S. Babiuk, T. R. Bowden, G. Parkyn [et al.] // Transbound. Emerg. Dis. – 2008. – Vol. 55, No. 7. – P. 299–307; doi: 10.1111/j.18651682.2008.01024.x.Quantification of lumpy skin disease virus following experimental infection in cattle / S. Babiuk, T. R. Bowden, G. Parkyn [et al.]. Transbound. Emerg. Dis. 2008. Vol. 55 (7): P. 299–307; doi: 10.1111/j.18651682.2008.01024.x.The novel Capripoxvirus vector lumpy skin disease virus (LSDV) efficiently boosts MVA HIV responses in rhesus macaques / W. A. Burgers, Z. Ginbot, Y.-J. Shen [et al.] // J. Gen. Virol. – 2014. – Vol. 95. – P. 2267–2272; doi: 10.1099/vir.0.067835-0.The novel Capripoxvirus vector lumpy skin disease virus (LSDV) efficiently boosts MVA HIV responses in rhesus macaques / W. A. Burgers, Z. Ginbot, Y.-J. Shen [et al.]. J. Gen. Virol. 2014. Vol. 95: P. 2267–2272; doi: 10.1099/vir.0.067835-0.

The authors declare that there are no conflicts of interest present.